殺螟硫磷重組單鏈抗體研究.pdf

1、重慶大學(xué)博士學(xué)位論文殺螟硫磷重組單鏈抗體研究姓名：羅義輝申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：夏玉先20111211重慶大學(xué)博士學(xué)位論文④將構(gòu)建的ScFv文庫經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄／翻譯后，產(chǎn)生了三元復(fù)合體(單鏈抗體核糖體mRNA，ARM)文庫。用殺螟硫磷OVA對產(chǎn)生的ARM三元復(fù)合體進(jìn)行親和篩選，洗滌后，使保留的三元復(fù)合體解離，再對釋放的mRNA進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增獲得篩選后的ScFvDNA文庫，重復(fù)上述過程，得到經(jīng)三輪篩選后的ScFvDNA文庫

2、。⑤將原始ScFv文庫DNA和經(jīng)過三輪篩選的ScFv文庫DNA分別與噬菌體表達(dá)載體pPOW30相連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a中表達(dá)。然后后用間接ELISA分析單鏈抗體與殺螟硫磷OVA的結(jié)合活性。結(jié)果表明從原始ScFv文庫中隨機(jī)挑取的50個克隆子的表達(dá)產(chǎn)物與殺螟硫磷OVA幾乎沒有結(jié)合能力；而從經(jīng)過三輪篩選后的ScFv文庫中挑取的100個克隆子中有25％與殺螟硫磷一OVA有較好的結(jié)合能力。從三輪篩選后的ScFv文庫中共挑取了190個克隆子，

3、用間接ELISA法初篩到50株抗原陽性的ScFv。然后用生物傳感技術(shù)對ELISA篩選呈陽性的ScFv進(jìn)行了復(fù)篩，獲得了3株高親和力的單鏈抗體(ScFvAF50、ScFv—AF93和ScFvAFl32)，用于下一步的表達(dá)、純化和分析。⑥將篩選的抗原陽性ScFv進(jìn)行了特性研究。單鏈抗體(ScFvAF50、ScFvAF93和ScFvAFl32)特異性強(qiáng)、親和力高。殺螟硫磷對它們的ICso分別為16、34和22I∥ml，檢測限分別是O02、00

4、7和001ng／ml。它們與其它有機(jī)磷(甲基對硫磷、乙酰甲胺磷、馬拉硫磷、樂果、三唑磷、毒死蜱)交叉反應(yīng)低，除了與甲基對硫磷有一定的交叉反應(yīng)(Q8％)，其余的均小于01％。Biacorc分析其親和力表明，單鏈抗體ScFvAFS0、ScFvAF93和ScFvAFl32的解離平衡常數(shù)分別為45610doM、14210。9M和266x10。10M。⑦分析了ScFv基因的序列特征。IMGT(intemationalimmunogeneticsd

5、atabase)軟件分析單鏈抗體DNA序列，表明單鏈抗體scFvAF50和AFl32重鏈屬于VH4基因家簇，scFvAF93重鏈屬于VHl基因家簇；三株單鏈抗體的輕鏈均屬于VkIV亞基因家簇。序列同源性通過basiclocalalignmentsearchtool(BLAST)軟件分析，表明scFvAF50和AF93重鏈有97％的同源性，scFvAFS0和AFl32輕鏈有89％的同源性。⑧以我們篩選的ScFvAFl32為抗體蛋白，以競爭