鼠源抗柑橘潰瘍病菌Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、柑橘潰瘍病(citrus bacterial canker disease，CBCD）是由黃單胞菌屬的柑橘黃單胞柑橘亞種（Xanthomonas citri subsp. Citri，Xcc)引起的一種危害全球柑橘種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害之一，廣泛發(fā)生在世界各主要柑橘產(chǎn)區(qū)，包括亞洲、大洋洲、馬來(lái)群島以及南北美洲。柑橘潰瘍病菌能感染絕大多數(shù)栽培柑橘品種，雖然很少會(huì)將寄主直接殺死，但會(huì)導(dǎo)致落葉、落果、樹勢(shì)衰弱、果實(shí)生銹斑和品質(zhì)變劣，嚴(yán)重降

2、低了商品價(jià)值。長(zhǎng)期以來(lái)由于特效藥劑和抗病品種的缺乏，只能采取強(qiáng)化植物檢疫，嚴(yán)防疫害傳入，對(duì)病樹挖除并集中燒毀的根除方法。目前我國(guó)正在實(shí)施柑橘非疫生產(chǎn)區(qū)建設(shè)，迫切需要建立特異、快速、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)及防控措施。
　　 基因工程重組單抗（包括Fab，scFv，F(xiàn)v 等）兼具診斷和治療雙重功能，是一種新型的免疫學(xué)檢測(cè)試劑，利用抗原－抗體特異性結(jié)合原理，可用于植物病害、人類疾病的診斷、治療和預(yù)防。而且與單克隆或多克隆抗體相比，重組單抗具有

3、高特異性，高親和力，低檢測(cè)限，易于在原核系統(tǒng)中大量表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。scFv 抗體由于具有低或無(wú)免疫原性、分子量小、組織穿透力強(qiáng)，成本低，可以大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但是在很多情況下容易聚集，不穩(wěn)定，制約了其在實(shí)際中的應(yīng)用。而 Fab 抗體是由抗體的輕鏈片段及重鏈Fd 段組成的，與單鏈抗體scFv 相比，具有穩(wěn)定性好，制備簡(jiǎn)單，可直接在大腸桿菌中表達(dá)有活性的抗體等優(yōu)點(diǎn)。目前，關(guān)于抗柑橘潰瘍病菌的Fab重組抗體尚未見報(bào)道，因此，

4、本研究利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)構(gòu)建了Fab抗體文庫(kù)，可望為柑橘潰瘍病血清學(xué)診斷提供新型的診斷試劑，而且還可望用于對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌的免疫抑制以及闡明靶標(biāo)病原細(xì)菌與寄主細(xì)胞相互作用、識(shí)別入侵的分子機(jī)理提供新的技術(shù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ①用生理鹽水稀釋的柑橘潰瘍病菌細(xì)胞懸浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效價(jià)為6400倍左右，符合建庫(kù)要求。
　　 ②提取小鼠脾細(xì)胞總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 第一鏈，用特異性的引物通過(guò)P

5、CR 條件的優(yōu)化分別成功擴(kuò)增出了抗體的輕鏈（680bp 左右）及重鏈的Fd 段（680bp左右）基因，并且通過(guò)序列測(cè)定比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)了擴(kuò)增出的為抗體相應(yīng)基因。
　　 ③通過(guò)Sac I、Xba I位點(diǎn)，將輕鏈基因連接到載體 pComb3x，成功構(gòu)建了抗體輕鏈文庫(kù)，其庫(kù)容量為1×106，重組率為100％。
　　 ④通過(guò)XhoI、Spe I位點(diǎn)，將抗體重鏈Fd 段基因連接到抗體輕鏈文庫(kù)中，成功構(gòu)建了庫(kù)容為2×106，重組率為