獼猴桃潰瘍病菌突變體庫構(gòu)建及其phaselotoxin合成相關(guān)基因的克隆.pdf

1、獼猴桃潰瘍病對于獼猴桃產(chǎn)業(yè)來說是一種具有毀滅性的細(xì)菌性病害。目前，獼猴桃潰瘍病在中國、意大利、新西蘭等國家嚴(yán)重發(fā)生，嚴(yán)重制約著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)是獼猴桃潰瘍病的病原菌。其中 phaseolotoxin毒素是獼猴桃潰瘍病發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素。然而，該毒素對獼猴桃潰瘍病菌致病機(jī)制的影響尚未明確。因此我們通過轉(zhuǎn)座子誘變的方法得到 phaseolo

2、toxin毒素合成喪失突變株，克隆得到 phaseolotoxin毒素相關(guān)基因，明確了獼猴桃潰瘍病菌基因中phaseolotoxin毒素相關(guān)基因的功能，為揭示phaseolotoxin毒素致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下：
　　1.獼猴桃潰瘍病菌 Tn5突變體庫的構(gòu)建以獼猴桃潰瘍病菌產(chǎn)phaseolotoxin毒素菌株 AHP18為材料，利用 EZ-Tn5 Tnp Transposome轉(zhuǎn)座系統(tǒng)

3、，在電壓1200 V/cm的條件下電擊5 ms，將含有卡那抗性基因的EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子插入到AHP18的基因組中，構(gòu)建獼猴桃潰瘍病菌的Tn5插入突變體庫，共獲得254株突變株。通過在含卡那霉素50μg/mL的LB平板上連續(xù)繼代培養(yǎng)7代，初步確定Tn5穩(wěn)定插入到獼猴桃潰瘍病菌的基因組中。
　　2. Phaseolotoxin毒素合成喪失突變株的篩選根據(jù)篩選獲得的最佳產(chǎn)毒體系，及利用在M9培養(yǎng)基中，初始濃度 OD600為0.1，18℃

4、培養(yǎng)48 h，獲得EZ-Tn5突變株和AHP18野生型菌株的粗提取物。利用室內(nèi)平板 Escherichia coli生長抑制試驗(yàn)方法初篩得到毒素合成喪失突變株19株。為了進(jìn)一步確定毒素合成喪失突變株，我們利用冷凍干燥濃縮手段將獲得的突變株產(chǎn)生的粗提取物進(jìn)行濃縮，運(yùn)用 E. coli生長抑制試驗(yàn)和TLC吸附層析方法進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選得到6株phaseolotoxin毒素合成喪失和減弱的突變株。
　　3.獼猴桃潰瘍病菌phaseolo

5、toxin毒素喪失突變株的鑒定根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的引物PsaF1/PsaR2，PsaF3/PsaR4對獲得的突變株進(jìn)行雙重PCR檢測，結(jié)果表明在175 bp和280 bp位置處出現(xiàn)兩條目的條帶，確定突變株是由野生型菌株突變而來；根據(jù) EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子的特有序列，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)座子特異性引物對 EZ-Tn5F（ AGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAG）/ EZ-Tn5R（ AACATCATTGGCAAC GCTACCT），對獲得的突變株進(jìn)行轉(zhuǎn)

6、座子特異性PCR，通過PCR獲得1060 bp的目的片段，從而驗(yàn)證了EZ-Tn5穩(wěn)定插入到毒素合成喪失突變體的基因組中。
　　4. Tn5插入失活基因的克隆及其序列分析根據(jù)轉(zhuǎn)座子EZ-Tn5兩端的序列，設(shè)計(jì)3對嵌套引物，同時(shí)依據(jù)物種蛋白質(zhì)普遍存在的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物，采用TAIL-PCR方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。以毒素合成喪失突變株AHP1846，AHP1879的基因組DNA為模板，用簡并引物和嵌套引物組成的引物組

7、合進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明利用左端引物L(fēng)SP1，LSP2，LSP3從突變株AHP1846基因組中克隆得到293 bp的序列。對獲得的側(cè)翼序列利用DNAStar、DNAMAN以及NCBI網(wǎng)站上的BLAST等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果與P. syringae pv. actinidiae公布的glmS基因同源性為100％，該基因編碼6-磷酸果糖谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶（L-glutamine:D-fructose-6-phosphat

8、e aminotransferase，簡稱GFAT）。
　　根據(jù)已公布的獼猴桃潰瘍病菌和其他革蘭氏陰性細(xì)菌的glmS基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物對GF/GR，以獼猴桃潰瘍病菌野生型菌株AHP18的基因組為模板，獲得了1836 bp的片段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與P. syringae pv. actinidiae公布的glmS基因同源性為100%，確定側(cè)翼序列位于glmS基因的916-1133的位置處。
　　為了驗(yàn)證EZ-Tn5轉(zhuǎn)座子在毒素喪失突

9、變株AHP1846的基因組中插入的拷貝數(shù)，我們根據(jù)轉(zhuǎn)座子序列設(shè)計(jì)探針引物TZF/TZR，DNA探針利用地高辛標(biāo)記，將AHP1846的基因組DNA經(jīng)過HindⅢ限制性內(nèi)切酶消化后通過Southern雜交法來分析。Southern雜交結(jié)果得到一條單一的條帶，表明轉(zhuǎn)座子EZ-Tn5在AHP1846的基因組中為單拷貝插入。
　　5.轉(zhuǎn)座子插入失活基因?qū)ΛJ猴桃潰瘍病菌致病性的影響利用針刺注射法將突變株AHP1846和AHP1879和野生型菌

10、株AHP18接種煙草，結(jié)果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突變株AHP1879均未誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過敏性反應(yīng)，而野生型菌株 AHP18對煙草誘導(dǎo)出明顯的過敏癥狀。通過摩擦接種法接種獼猴桃離體和活體的葉片，結(jié)果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突變株AHP1879對獼猴桃葉片喪失致病力，而接種野生型菌株 AHP18的葉片出現(xiàn)典型的褐色斑。通過創(chuàng)傷接種法接種獼猴桃離體和活體的嫩枝，結(jié)果2個(gè)突變株均喪失致病力，而接種野生型菌株的嫩枝在接