利用原核系統(tǒng)表達富含二硫鍵蛋白質的探索與改進.pdf

1、隨著基因工程的發(fā)展，工業(yè)化生產的蛋白類制品越來越多，其市場前景也越來越廣闊。利用外源蛋白表達系統(tǒng)生產具有重要價值的蛋白是現(xiàn)代生物技術產業(yè)的核心內容和研究熱點，大腸桿菌作為當今世界上應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)，有眾多優(yōu)點：大腸桿菌是第一個用于重組蛋白生產的宿主菌，它不僅遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉化效率高、生長繁殖快、成本低廉、待選質粒和宿主多，可以快速大規(guī)模地生產目的蛋白，而且其表達外源基因產物的水平遠高于其它蛋白表達系統(tǒng)，表達的目的

2、蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的30％。然而有些重組蛋白質制品特別是富含二硫鍵的蛋白質在大腸桿菌中表達常常為無活性的包涵體，具有生物活性蛋白質的獲得需采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，但哺乳細胞表達體系產率低、成本高、周期長、培養(yǎng)要求條件高等缺點嚴重限制了基因工程制品的推廣應用。因此改善大腸桿菌表達系統(tǒng)使之可以應用于富含二硫鍵蛋白質的表達，是一個挑戰(zhàn)性的課題。本課題選取具有工業(yè)化前景且富含二硫鍵的曲霉植酸酶作為研究目標，探索和改進其在大腸桿菌中的

3、表達，通過基因操作將該基因分別連接4種不同的周質定位信號肽序列及利用兩株具有氧化型胞質的大腸桿菌突變株來表達目的蛋白，以促進二硫鍵的形成，結果使植酸酶在原核表達中的活性大大提高；我們同時還對不同菌株的最佳表達條件進行了優(yōu)化。主要結果如下：
　　 1．具有氧化型細胞質的工程菌株能夠明顯提高植酸酶的活性。構建植酸酶原核表達載體，利用兩種氧化型突變大腸桿菌菌株作為宿主表達植酸酶，由于氧化型突變菌株的胞質環(huán)境及氧化狀態(tài)的硫氧還蛋白家族類

4、蛋白質有利于二硫鍵的形成，使植酸酶活性有明顯提高，突變株Rosetta-gami（DE3）與一般普通表達菌株比，在一般誘導培養(yǎng)條件下植酸酶活性提高234％，另一株突變菌株TransB（DE3），其植酸酶活性也提高了220％。
　　 2．植酸酶周質定位有助于植酸酶活性的提高。實驗中選取含有周質定位作用信號肽的質粒pET27b（含有信號肽序列SSPelB）作為表達載體，信號肽與目的蛋白的融合可以促進目的蛋白從細胞質轉運到大腸桿菌的周

5、質中，而周質不但具有與胞質不同的氧化環(huán)境而且包含促進二硫鍵形成的Dsb酶系統(tǒng)。為了篩選運轉效率更高的信號肽，克隆得到了另外三種周質蛋白的信號肽序列即DsbA、DsbC及堿性磷酸酶的信號肽序列，分別命名為SSDsbA、SSDsbC和SSPhoA，用上述三種信號肽分別替代pET27b中原有的信號肽序列SSPelB，構建了三個新的表達載體。將植酸酶基因phyA分別插入這四個周質定位表達載體中，通過轉化大腸桿菌獲得了四株工程菌（SSPelB-P

6、hyA、SSDsbA-PhyA、SSDsbC-PhyA、SSPhoA-PhyA）。與一般普通表達菌株比，四株具有周質定位的工程菌所產植酸酶活性均有大幅提高，活性分別提高164％、246％、225％、186％。
　　 3．最佳發(fā)酵條件的篩選。設置不同的培養(yǎng)溫度、誘導劑濃度等條件，研究不同的發(fā)酵條件及組合對植酸酶表達量及酶活性的影響，通過30個不同的條件組合進行發(fā)酵優(yōu)化。發(fā)酵結果顯示，誘導劑濃度的改變對酶活性的影響比溫度改變影響明顯

7、，0.25mM IPTG是大多數(shù)菌株的最佳誘導劑濃度；溫度對植酸酶的表達及活性的影響較為復雜，不同工程菌株的最佳誘導溫度介于25℃～37℃溫度范圍。
　　 4．發(fā)酵條件優(yōu)化利于植酸酶活性的提高。經(jīng)過各個菌株最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化，利用信號肽將植酸酶周質定位的菌株中SSDsbA-PhyA活性提高最為明顯，在其最佳發(fā)酵條件28℃/0.25mM IPTG下相對于使植酸酶定位于還原型胞質可以使植酸酶催化活性提高525％；氧化型細胞質的菌株中