PRRSVJL-07-SW分離株GP5基因克隆與真核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒美洲型毒株VR-2332株的基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)GP5基因特異性引物P1/P2，以PRRSVJL/07/SW毒株細(xì)胞培養(yǎng)物為模板,利用RT-PCR方法，成功擴(kuò)增出GP5基因，然后以pMD18-T為載體對(duì)GP5基因進(jìn)行克隆。序列測(cè)定結(jié)果表明，GP5基因全長(zhǎng)603bp，編碼201個(gè)氨基酸；序列分析表明，GP5基因與VR-2332株和LV株核苷酸同源性分別為91.6％及48.7％，編碼氨基酸同源性分別為87.6％及6

2、0.0％。
　　 將GP5基因亞克隆到pCI-neo表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCI-GP5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞中，用間接免疫熒光試驗(yàn)、SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果表達(dá)出約25Kda融合蛋白，經(jīng)Western-blot免疫印跡分析，重組蛋白與抗PRRSV的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有抗原活性。
　　 用重組表達(dá)的融合GP5蛋白作為包被抗原，經(jīng)Western-blot分析表明，該重組蛋白可以

3、與PRRSV陽性血清反應(yīng)并具有良好的反應(yīng)性，以此純化的重組蛋白建立了診斷PRRS的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)確定了最佳抗原包被濃度為2.30μg/mL，PRRSV陽性血清稀釋度為1:100。用間接ELISA方法檢測(cè)PRRS與豬的其它常見疾病均無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。
　　 本論文研究PRRSV GP5基因的克隆與分析，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)將PRRSV GP5基因與真核表達(dá)載體pCI-neo連接并建立間接ELISA方法，對(duì)PRRSV J