轉基因干涉ie-2和lef-3基因對BmNPV體外增殖的影響.pdf

1、家蠶核型多角體病毒是蠶業(yè)生產上最常見且危害最嚴重的一類病原微生物，對其研究具有重要的科學意義和產業(yè)應用價值。本實驗選擇了家蠶核型多角體病毒的早期表達基因ie2及晚期表達因子lef3這兩個與病毒復制、增殖密切相關的基因作為抑制靶標，通過構建能穩(wěn)定轉錄形成靶標基因dsRNA的轉基因干涉載體(pigA3EGFP-39KPie2，pigA3EGFP-39KPlef3，pigA3EGFP-IE1Plef3)轉染家蠶胚胎細胞系(BmE)。通過G41

2、8的壓力選擇，獲得能穩(wěn)定產生dsRNA的三種轉基因細胞系。線性化修飾過的病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV的攻毒試驗表明：轉基因細胞能產生目標基因dsRNA，對病毒在細胞中的復制、增殖均有一定的抑制作用。
　　 本實驗具體研究內容如下：
　　 (1)、靶基因片段的克隆
　　 克隆了家蠶核型多角體病毒(BmNPV)復制和增殖過程中的比較重要的兩個基因——極早期表達基因ie-2和晚期表達因子lef-3的部分區(qū)

3、域：ie-2基因的+623～+1186區(qū)域(共564bp)和lef-3基因的+233～+926區(qū)域(共694bp)的片段。
　　 (2)、轉基因干涉載體的構建
　　 利用包含兩個不同啟動子——極早期表達基因ie-1的啟動子和遲早期基因39k的啟動子的載體骨架，將目的基因片段以反向串聯(lián)方式連接，構建轉基因干擾載體pigA3-EGFP-39KPie2、pigA3-EGFP-39KPlef3和pigA3-EGFP-IE1Ple

4、f3。這些載體上都含有EGFP作為報告基因，以neo作為抗性篩選標記。
　　 (3)、篩選并獲得轉基因干涉細胞系
　　 對實驗室保存的對BmNPV敏感的家蠶胚胎細胞系(BmE)進行轉染，并通過抗生素G418壓力篩選獲得了穩(wěn)定表達干涉靶基因相應dsRNA的轉基因細胞。
　　 (4)、轉基因干涉載體對病毒體外增殖的影響
　　 分別接種線性化修飾過的家蠶核型多角體病毒Bm-BacPAK6和野生型BmNPV，研究