轉(zhuǎn)基因干涉BmNPV病毒的gp64與lef-1基因片段對病毒體外增殖的影響.pdf

1、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)是蠶業(yè)生產(chǎn)上最常見且危害最嚴(yán)重的一類病原，一旦爆發(fā)對蠶業(yè)影響巨大，如何增強(qiáng)家蠶對該病毒的抗性一直是蠶業(yè)研究的熱點(diǎn)。BmNPV病毒基因組全序列的測定讓我們對這一病原認(rèn)識得愈發(fā)清晰，某些必需基因?qū)mNPV病毒的增殖復(fù)制起著關(guān)鍵作用。因此，抑制這些必需基因的功能性表達(dá)成為防治家蠶感染BmNPV的一種有效策略。雙鏈RNA介導(dǎo)的干擾現(xiàn)象能夠特異的介導(dǎo)靶標(biāo)基因表達(dá)沉默，是生物界進(jìn)化保守且古老的抗病毒機(jī)制。本研究選擇

2、家蠶核型多角體病毒侵染傳播過程中具有關(guān)鍵作用的gp64基因和病毒晚期表達(dá)調(diào)控基因lef-1作為靶標(biāo)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)與RNAi技術(shù)的結(jié)合，探討兩個基因片段相應(yīng)dsRNA對病毒體外復(fù)制、增殖的影響，為日后培育家蠶抗病毒品系奠定基礎(chǔ)。本研究主要獲得了如下研究結(jié)果：
　　 1.干涉靶基因的克隆及轉(zhuǎn)基因干擾載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)已報道的BmNPV病毒基因組序列，分別設(shè)計引物克隆了gp64基因+233～+867區(qū)域和lef-l基因+

3、85～+754區(qū)域的反向互補(bǔ)片段，經(jīng)測序驗(yàn)證正確后將目的基因片段以反向串聯(lián)方式分別連入包含兩個不同誘導(dǎo)型啟動子39K Promoter、LEF3 Promoter的載體骨架中，構(gòu)建了四個轉(zhuǎn)基因干擾載體并分別將其命名為pigA3-EGFP-39KPgp64、pigA3-EGFP-39KPlefl和pigA3-EGFP-LEF3Pgp64、pigA3-EGFP-LEF3Plef1。
　　 2.培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)目的基因相應(yīng)dsRNA的轉(zhuǎn)基

4、因細(xì)胞
　　 將獲得的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染家蠶胚胎細(xì)胞系BmE和卵巢細(xì)胞系BmN-SWU1，利用G418對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行兩個半月至三個月的壓力篩選，獲得了穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)靶基因相應(yīng)dsRNA的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的熒光率從轉(zhuǎn)染初期的10％左右分別達(dá)到70％和80％左右。
　　 3.靶基因dsRNA對病毒體外增殖的影響
　　 靶基因dsRNA對病毒增殖表現(xiàn)出較好的抑制作用，gp64相應(yīng)dsRNA的干涉效果優(yōu)于lef-1基