轉(zhuǎn)基因煙草中啟動(dòng)子活性對(duì)RNA介導(dǎo)的病毒抗性的影響.pdf

1、RNA干擾（RNA interference，RNAi）是外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA誘發(fā)地特異性降解與之同源的mRNA，從而導(dǎo)致相應(yīng)基因不表達(dá)的現(xiàn)象。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在于動(dòng)物、植物及真菌等生物體中，是生物細(xì)胞抵御外來遺傳因子入侵以保持自身基因組完整性的防御機(jī)制。對(duì)于它的機(jī)制，人們從轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄速率等不同角度研究影響RNA沉默的因素。啟動(dòng)子是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要的順式元件。為了檢測(cè)不同啟動(dòng)子

2、對(duì)RNA介導(dǎo)病毒抗性的影響，本研究選擇了裂葉矮牽牛堿性亮氨酸拉鏈的蛋白質(zhì)（PNZIP）基因啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子和玉米泛素蛋白（polyubiquitin）基因Ubi啟動(dòng)子三種啟動(dòng)子進(jìn)行研究，結(jié)果對(duì)于將來有效地選擇啟動(dòng)子成功應(yīng)用RNA介導(dǎo)的病毒抗性策略提供依據(jù)，具有重大指導(dǎo)意義。具體結(jié)果如下：
　　 1、PVYCP基因3’端的400bp和500bp為目的片段，分別插入到雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300

3、中，構(gòu)建莖長度為400bp，環(huán)長度100bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)植物表達(dá)載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR.
　　 2、將所構(gòu)建的植物表達(dá)載體p35S+IR、pUbi+IR、pPNZIP+IR及空pCAMBIA1300利用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。菌液PCR及酶切鑒定證明質(zhì)粒均已成功正確導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。
　　 3、葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89。經(jīng)卡那霉素對(duì)再生植株進(jìn)行抗性篩選，后經(jīng)PCR檢測(cè)，分別獲得轉(zhuǎn)pCAMB

4、IA1300的煙草30株，轉(zhuǎn)p35S+IR的煙草112株，轉(zhuǎn)pUbi+IR的煙草115株，轉(zhuǎn)pPNZIP+IR的煙草152株。
　　 4、以PVYN的病汁液為接種物，汁液摩擦接種轉(zhuǎn)基因煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了抗病性分析。癥狀觀察及ELISA檢測(cè)表明，不同的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)PVYN的抗性存在著差異。統(tǒng)計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)pPNZIP+IR、p35S+IR、pUbi+IR的煙草中，PVY抗性植株的比例分別為83.54％、65.18％和2

5、4.33％。
　　 5、轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot及siRNA的雜交分析表明，轉(zhuǎn)基因在RNA水平上都得到了表達(dá)，這種抗病性為RNA介導(dǎo)的抗病性，是RNA沉默的結(jié)果，但抗病性與siRNA的積累量二者并無相關(guān)性。
　　 6、啟動(dòng)子活性檢測(cè)通過啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行GUS活性分析。分別將約1800bp長度的GUS片段連在含有三個(gè)啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體之后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)卡那霉素篩選獲得若