豬Myostatin基因RNA干擾及啟動子研究.pdf

1、肌肉生長抑制素(MSTN),是TGF-β超家族成員,是肌肉細胞的自分泌因子,主要在動物骨骼肌中特異性表達并對肌肉的生長發(fā)育起到負調控作用。該基因敲除的小鼠,其骨骼肌重量增加到正常小鼠的兩倍左右。RNA干擾(RNAi)是一種特異性降解靶基因mRNA序列的基因表達調節(jié)機制,具有高效、特異、快速等優(yōu)點,已成為研究基因功能和表達調控的有效方法。因此,本實驗利用PCR方法以豬骨骼肌cDNA為模板克隆Myostatin基岡并構建真核表達載體pMST

2、N-1;針對豬肌生成抑制素基因mRNA3個干涉位點,設計合成三對特異的shRNA干擾序列和一對非特異的shRNA干擾序列,通過退火形成雙鏈后依次將其連入帶有U6啟動子的干涉載體pGenesil-1上,構建干擾載體。得到含四個目的DNA片段的重組質粒分別脂質體轉染過表達Myostatin細胞,利用realtime-PCR檢測各實驗組細胞中Myostatin在mRNA水平的表達,檢測干擾效果。結果表明3個干擾片段均在一定程度上下調了MSTN

3、mRNA的表達。shRNA1、shRNA2和shRNA3對MSTN基因的抑制率分別為69.82％、80.97％和87.52％,同時轉染shRNA0也能抑制MSTN基因的表達但是差異不顯著,3對干擾序列間干擾水平無明顯差異。
　　 同時本研究中,對Myostatin基因啟動子功能進行了研究。利用PCR方法從豬基因組DNA中分離了1.2kb的Myostatin基因啟動子(Pro)序列。該啟動子序列與已報道的GenBank序列:AJ1

4、33580和AY527153相應序列的相似度分別為100％和99.5％,進一步以GFP為報告基因,構建真核表達載體MSTNPro-EGFP:通過轉染C2C12小鼠骨骼肌成肌細胞系和豬成纖維細胞,對豬Myostatin基因啟動子的轉錄調控活性進行鑒定。結果表明,本實驗成功克隆了豬Myostatin基因啟動子,并且構建了真核表達載體,豬Myostatin基因啟動子可以啟動GFP在C2C12細胞中的轉錄和表達,而將豬MSTNProEGFP載體