抗草甘膦基因轉(zhuǎn)入玉米自交系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化.pdf

1、雜草與農(nóng)作物競(jìng)爭(zhēng)水分、養(yǎng)料和光照，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還是許多病蟲害的中間寄主或越冬場(chǎng)所，通過除草劑來控制雜草已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可缺少的一部分。但除草劑在消滅雜草的同時(shí)也對(duì)作物產(chǎn)生了傷害作用。目前，利用基因工程手段培育抗除草劑的作物品種解決了這一矛盾。 草甘膦(Glypphosate)是廣譜、非選擇性除草劑“RoUndup”(農(nóng)達(dá))的主要成分，能夠抑制植物芳香族氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EP

2、SPS)的活性，通過轉(zhuǎn)入外源編碼EPSPS的基因可提高植物對(duì)草甘膦的抗性。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是目前玉米遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法之一，具有能轉(zhuǎn)移大片段DNA，整合的外源基因拷貝數(shù)較少，并且基因重排頻率較低等優(yōu)點(diǎn)。雖然國(guó)外已建立了基于玉米模式種質(zhì)A188自交系和Hi-Ⅱ雜交種的高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但是沒有建立具有生產(chǎn)價(jià)值的優(yōu)良玉米自交系的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，還存在轉(zhuǎn)化頻率低，重復(fù)性較差，隨機(jī)性大等問題，轉(zhuǎn)基因成功的事例還不十

3、分普遍。因此建立基于國(guó)內(nèi)優(yōu)良玉米自交系的高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)于促進(jìn)玉米轉(zhuǎn)基因育種和基因的功能研究具有重要意義。 本研究將來源于微生物的EPSPS編碼基因G2-aroA單獨(dú)或者與豌豆1,5-二磷酸核酮糖羧化酶基因葉綠體前體蛋白信號(hào)肽ssu連接后，由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)分別轉(zhuǎn)化煙草，檢測(cè)G<,2>-aroA基因的抗草甘膦功能；將EPSPS編碼基因G<,2>-aroA與信號(hào)肽SSU連接后，由玉米泛素基因啟動(dòng)子Ubiq

4、uitin驅(qū)動(dòng)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良自交系齊319和R18-599；對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了一系列優(yōu)化。主要結(jié)果如下： 1.將單獨(dú)的G<,2>-aroA基因和連接有信號(hào)肽的G<,2>-aroA基因(ssu-G<,2>-aroA)分別轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明： ssu-G<,2>-aroA轉(zhuǎn)基因煙草植株、G<,2>-aroA轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)草甘膦的抗性分別為：5.0mM、4.0mM、2.0mM。轉(zhuǎn)基因煙草

5、植株對(duì)草甘膦抗性高于非轉(zhuǎn)基因煙草植株，而轉(zhuǎn)SSU-G<,2>-aroA基因的煙草植株對(duì)草甘膦的抗性高于轉(zhuǎn)G<,2>-aroA基因的植株。表明G<,2>-aroA基因提高了煙草植株對(duì)草甘膦的抗性，而且葉綠體引導(dǎo)肽.ssu使轉(zhuǎn)G<,2>-aroA基因的煙草植株的草甘膦抗性得到進(jìn)一步提高。 2.將ssu-G<,2>-aroA基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化國(guó)內(nèi)優(yōu)良玉米自交系齊319和R18-599，得到轉(zhuǎn)基因T<,0>代果穗。對(duì)T<,0>代植

6、株進(jìn)行了PCR、PCR-Southern以及RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：外源基因SSU-G<,2>-aroA已經(jīng)穩(wěn)定整合到了玉米基因組中，而且在RNA水平上得到表達(dá)。 3.對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化研究。于農(nóng)桿菌侵染并共培養(yǎng)3天后對(duì)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系。以EHA105菌株侵染玉米優(yōu)良自交系齊319幼胚的研究表明.侵染液的最佳侵染狀態(tài)為菌液振蕩培養(yǎng)2小時(shí)后加入抗生素，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6-8小時(shí)

7、，侵染前再加入乙酰丁香酮；侵染液最佳濃度OD<,600>為0.4-0.6；最適合用于轉(zhuǎn)化的幼胚大小為直徑1.5mm左右；最佳侵染時(shí)間為20分鐘；潮霉素篩選臨界濃度最高為5ag/L。以玉米自交系R18-599和齊319幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷為轉(zhuǎn)化受體的研究表明：愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大影響，以愈傷組織繼代兩次、預(yù)培養(yǎng)一周左右為侵染的最佳時(shí)期；最佳共培養(yǎng)條件以共培養(yǎng)基中添加200mg/L的AS、共培養(yǎng)pH值為5.2、25℃共培養(yǎng)3天，