農(nóng)桿菌介導(dǎo)gna基因轉(zhuǎn)化玉米骨干自交系及轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲抗病性分析.pdf

1、據(jù)世界糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations；FAO)統(tǒng)計(jì)，在全世界范圍內(nèi)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的損失約占農(nóng)作物總收獲量的14%，損失約數(shù)千億美元，而每年因病害造成的損失約占農(nóng)作物總收獲量的12%。因此，保護(hù)作物免受病蟲危害是種植者和科研工作者所面臨的一項(xiàng)恒久的挑戰(zhàn)。玉米(Zea mays L.)是重要的農(nóng)作物之一，創(chuàng)造抗病蟲玉米新品系，提高產(chǎn)量、改良品

2、質(zhì)，是一項(xiàng)具有重要意義的工作。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次將來源于石蒜科植物雪花蓮的雪花蓮凝集素基因gna(Galanthus nivalis L. agglutinin gene)轉(zhuǎn)入4個(gè)玉米骨干自交系，獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因在后代的遺傳和目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了分析，檢測了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性和抗病性，為玉米育種提供了有重要價(jià)值的材料。 一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米骨干自交系的轉(zhuǎn)化及分子生物學(xué)檢測 選用玉米骨干自交系DH

3、4866、DH9942、DH9932、8902的未成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織，用攜帶雙元載體質(zhì)粒pWRG815(T-DNA區(qū)含gna基因)的農(nóng)桿菌菌株AGL0轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織經(jīng)20mg/L潮霉素篩選3代，存活愈傷組織經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后進(jìn)行分化，再生出大量表達(dá)GNA的可育轉(zhuǎn)基因植株。后者人工授粉自交結(jié)實(shí)。對轉(zhuǎn)基因植株當(dāng)代以及后代進(jìn)行PCR、Southern blot和Western blot分析，結(jié)果表明gna基因已經(jīng)整

4、合入玉米基因組中，并穩(wěn)定表達(dá)。在部分T2、T3代株系中轉(zhuǎn)基因gna已達(dá)到純合。轉(zhuǎn)基因植株Southern blot分析表明，在大多數(shù)轉(zhuǎn)化體中外源基因發(fā)生單拷貝插入，只在少數(shù)轉(zhuǎn)化體中發(fā)生了2~3拷貝插入。取gna基因發(fā)生單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因植株的葉片，提取可溶性蛋白進(jìn)行Western blot分析，并以非轉(zhuǎn)基因植株葉片的可溶性蛋白和雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis L. agglutinin；GNA)蛋白分別為陰性和陽性對照