3個(gè)玉米自交系幼胚轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立和CYP735A基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化.pdf

1、玉米(Zea Mays L.)是重要的糧飼兼用作物，用基因工程方法將優(yōu)良基因轉(zhuǎn)入優(yōu)良玉米自交系是當(dāng)前玉米高產(chǎn)育種的重要途徑之一。在玉米轉(zhuǎn)基因研究中，建立高效、穩(wěn)定的玉米遺傳受體系統(tǒng)不僅是轉(zhuǎn)化成功的重要前提，而且對(duì)提高轉(zhuǎn)化細(xì)胞分化和再生轉(zhuǎn)化苗獲得率，對(duì)利用基因工程手段進(jìn)行自交系的改良和應(yīng)用具有重要意義。本研究以3個(gè)優(yōu)良玉米自交系18-599、齊319和A188為轉(zhuǎn)化受體試材，對(duì)幼胚轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立進(jìn)行探索，研究了影響轉(zhuǎn)化過程的多個(gè)因素，

2、并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了CYP735A基因。獲得的主要結(jié)論如下：
　　 1、幼胚取材時(shí)間(生理狀態(tài))和組培條件對(duì)愈傷誘導(dǎo)和植株再生有重要影響。取授粉后10～15 d的雌穗，幼胚長度1.6～2.0 mm，盾片向上擺放,25℃培養(yǎng)，幼胚膨大速度最快，形成的胚性愈傷多。高濃度的2,4-D(3.0 mg L-1)是誘導(dǎo)愈傷組織所必須的；在繼代培養(yǎng)基中加2,4-D(3.0 mg L-1)+NAA(0.2 mg L-1)可以顯著增加齊319和

3、18-599的胚性愈傷組織的形成,2,4-D(3.0 mg L-1)+NAA(0 mg L-1)組合對(duì)A188的幼胚愈傷誘導(dǎo)效果最好，且都對(duì)生芽有較好的抑制作用。在分化培養(yǎng)過程中，1/2 MS培養(yǎng)基附加0.5 mg L-1激動(dòng)素(KT)適合玉米分化生根；生根培養(yǎng)時(shí)，0.5 mg L-1的ABT可以促進(jìn)再生芽生根，并可增加再生苗的生根數(shù)量。
　　 2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化影響因素的研究表明，不同基因型的轉(zhuǎn)化條件存在差異，齊319和18-

4、599在菌液OD600<0.4時(shí)浸染效果較好；A188浸染菌液OD600<0.2為宜；在浸染時(shí)間為10 min時(shí)，采用加濾紙20℃共培養(yǎng)3 d的方法更容易控制浸染過程，且利于提高T-DNA轉(zhuǎn)移效率；在3輪篩選培養(yǎng)中，齊319和A188的巴龍霉素(PRM)適宜篩選濃度依次為80、100和80 mg L-1，18-599為100、120和100 mg L-1。
　　 3、用優(yōu)化后的受體系統(tǒng)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)3個(gè)自交系進(jìn)行CYP73

5、5A基因的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化苗約300株，移栽成活率約為30％。針對(duì)轉(zhuǎn)化植株的目的基因CYP735A和標(biāo)記基因NPTⅡ進(jìn)行PCR檢測，共獲得8株齊319轉(zhuǎn)CYP735A基因陽性植株,4株18-599轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中有2株齊319經(jīng)RT-PCR檢測呈陽性，18-599也獲得RT
　　 -PCR陽性植株3株。初步證實(shí)CYP735A和NPTⅡ基因已整合到玉米基因組中。
　　 4、玉米胚性愈傷組織的誘導(dǎo)受基因型及組培條件等多種因