“全紅”體色甌江彩鯉MHC多態(tài)性及其與魚體抗病力關(guān)系的分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex,MHC)是存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)與免疫功能密切相關(guān)的高度多態(tài)的基因群。許多研究表明,MHC不同等位基因與機(jī)體的抗病力密切相關(guān)。本研究以分布于我國(guó)浙江省甌江流域的地方性鯉科魚類——甌江彩鯉(Cyprinus carpio var. color)為對(duì)象,通過人工感染嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)后,分析“全紅”體色甌江彩鯉MHC基因

2、家族中MHC Iα、MHC IIα和MHC IIβ等位基因的多態(tài)性及其與魚體抗病力之間的關(guān)系。研究結(jié)果將為甌江彩鯉抗病相關(guān)基因的篩選及抗病育種奠定基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下:
　　1、“全紅”體色甌江彩鯉MHC-DAB基因多態(tài)性及其與魚體抗病力關(guān)系的分析
　　利用一對(duì)特異性引物DABF和DABR,分別從21尾感病和16尾抗病“全紅”體色甌江彩鯉的cDNA中,擴(kuò)增出長(zhǎng)度為624bp的MHC-DAB基因片段。共測(cè)序185個(gè)有

3、效克隆,獲得76個(gè)不同的核苷酸序列。MHC-DAB基因片段包括第1~4外顯子,分別編碼信號(hào)肽、β1和β2結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)。長(zhǎng)度為276bp的β1結(jié)構(gòu)域有144個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(52.17％)和70個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(76.07%),而長(zhǎng)度為282bp的β2結(jié)構(gòu)域只有98個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(34.75%)和50個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(53.19%),顯示β1結(jié)構(gòu)域的變異要明顯大于β2結(jié)構(gòu)域。在β1結(jié)構(gòu)域的24個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(PBR)上,有23個(gè)發(fā)生了

4、變異。β1結(jié)構(gòu)域的PBR、非抗原結(jié)合位點(diǎn)(non-PBR)及β2結(jié)構(gòu)域的ω值(ω=dN/dS)分別為1.367、0.886和0.754,表明“全紅”體色甌江彩鯉 MHC-DAB基因(特別是β1結(jié)構(gòu)域)在進(jìn)化過程中受到正向選擇作用。在所得的20個(gè)不同的等位基因中,基因 DAB3*15在抗病群體中出現(xiàn)的頻率(13.75%)顯著高于感病群體中出現(xiàn)的頻率(3.81%)(P<0.05);基因 DAB3*09和DAB3*10的出現(xiàn)頻率都為3.75%

5、(P<0.05),僅存在于抗病群體中;而基因 DAB3*02和DAB3*14的出現(xiàn)頻率分別為7.62%(P<0.05)和8.57%(P<0.01),僅存在于感病群體中。
　　2、“全紅”體色甌江彩鯉MHC IIα基因多態(tài)性及其與魚體抗病力關(guān)系的分析
　　根據(jù)已知鯉(Cyprinus carpio)的主要組織相容性復(fù)合體MHC IIα基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,分別從21尾感病和16尾抗病“全紅”體色甌江彩鯉cDNA中擴(kuò)增了包括M

6、HC IIα基因完整外顯子2和外顯子3在內(nèi)的長(zhǎng)度為624bp的基因片段。共測(cè)序180個(gè)有效克隆,獲得85條不同的核苷酸序列,分屬10個(gè)不同的等位基因。MHC IIα基因片段包括第1~4外顯子,分別編碼信號(hào)肽、α1和α2結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)。α1結(jié)構(gòu)域的變異要明顯大于α2結(jié)構(gòu)域,表現(xiàn)在:長(zhǎng)度為252bp的α1結(jié)構(gòu)域有105個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(41.67%)和49個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(58.33%),而長(zhǎng)度為285bp的α2結(jié)構(gòu)域的核苷酸、氨基酸變異位

7、點(diǎn)卻較少,分別為84個(gè)(29.47%)和43個(gè)(45.26%)。在α1結(jié)構(gòu)域的21個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(PBR)上,有15個(gè)發(fā)生了變異。α1結(jié)構(gòu)域的PBR、非抗原結(jié)合位點(diǎn)(non-PBR)及α2結(jié)構(gòu)域的ω值(ω=dN/dS)分別為3.982、0.725和0.500,表明“全紅”體色甌江彩鯉MHC IIα基因(特別是α1結(jié)構(gòu)域)在進(jìn)化過程中受到正向選擇作用。在所得的10個(gè)不同的等位基因中,基因Cyca-DXA7只出現(xiàn)在抗病群體中,頻率為9.09

8、%,達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)。
　　3、“全紅”體色甌江彩鯉 MHC I類基因的克隆與多態(tài)性分析
　　為了解“全紅”體色甌江彩鯉 MHC I類基因的多態(tài)性,本研究從30尾樣本的cDNA中,克隆出18尾魚的MHC I類基因,成功測(cè)序75個(gè)克隆并獲得長(zhǎng)度為972bp~993bp的核苷酸序列71條。這些序列編碼324~331個(gè)氨基酸,包括完整的信號(hào)肽、α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域、連接肽、跨膜區(qū)及部分胞質(zhì)區(qū)。71條核苷酸序列編碼

9、49條不同的氨基酸序列,可歸為11個(gè)等位基因;總的核苷酸、氨基酸變異位點(diǎn)比例分別為45.68%和60.84%,而核苷酸/氨基酸序列間的變異范圍分別為0%~57.7%和0%~75.9%,都表明“全紅”體色解甌江彩鯉MHC I類基因的多態(tài)性很豐富。分析表明,α1、α2結(jié)構(gòu)域的核苷酸/氨基酸變異位點(diǎn)比例分別為65.90%/79.31%、56.38%/72.34%,都明顯高于α3結(jié)構(gòu)域的30.24%和46.39%。α1和α2結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合區(qū)(P