鯉第四輪全基因組復(fù)制時(shí)間及鯉CC型趨化因子的研究.pdf

1、背景:科學(xué)界研究發(fā)現(xiàn)鯉相對(duì)于斑馬魚經(jīng)歷了額外的一輪全基因組復(fù)制。在全基因組還沒(méi)測(cè)序或還沒(méi)完成的物種中,已經(jīng)有研究學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)分析物種基因組復(fù)制事件的存在以及復(fù)制時(shí)間的問(wèn)題。因此,鯉大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有利于我們研究鯉額外的基因組復(fù)制事件發(fā)生的大致時(shí)間。趨化因子家族是一類能誘導(dǎo)白細(xì)胞激活和遷移的趨化性細(xì)胞因子家族,是魚類先天免疫的重要組成部分。CC類家族是趨化因子家族中最大的家族之一。隨著越來(lái)越多的魚類基因組測(cè)序計(jì)劃的開展,以及轉(zhuǎn)錄組

2、測(cè)序結(jié)果的積累,比較基因組學(xué)方法能幫助我們鑒定魚類CC趨化因子。但是,到目前為止,鯉CC趨化因子研究較少,僅 Kazuhiro等報(bào)道了鯉的一個(gè)CC型趨化因子(GenBank序列號(hào)為 AB010469),公共數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的鯉轉(zhuǎn)錄組序列有利于鯉CC趨化因子的挖掘。
　　結(jié)果:本研究將對(duì)鯉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行454焦磷酸測(cè)序得到的讀長(zhǎng),通過(guò)裝配得到8,422 contigs and60,910 singletons。然后將這些contigs和si

3、ngletons與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的公開的鯉轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行混合裝配,最終得到49,669條沒(méi)有冗余的contigs,并利用同源比對(duì)和重頭預(yù)測(cè)的方法對(duì)這些contigs進(jìn)行蛋白編碼基因的鑒定;利用鯉contigs與斑馬魚已有的轉(zhuǎn)錄組序列鑒定了4,651個(gè)直系同源對(duì),同時(shí)在鯉內(nèi)部篩選得到129,984個(gè)旁系同源對(duì)。對(duì)直系同源對(duì)的同義替換率進(jìn)行計(jì)算分析,表明鯉和斑馬魚的分化時(shí)間大概在1億2千萬(wàn)年前。本研究鑒定了鯉和斑馬魚分化之后,鯉的又一輪基因組

4、復(fù)制事件大概發(fā)生在560萬(wàn)~1130萬(wàn)年前.而在斑馬魚中未鑒定到物種分化后的基因組復(fù)制現(xiàn)象;表明相對(duì)于斑馬魚,鯉又經(jīng)歷了一輪基因組復(fù)制。本研究還對(duì)鯉重疊群和斑馬魚基因進(jìn)行了基因本體(Gene Ontology,GO)和KEGG通路的功能注釋,發(fā)現(xiàn)了一些富集在鯉中的生物過(guò)程和生物通路。此外,本研究從公共數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘到鯉 CC類趨化因子家族中的一個(gè)基因,CCL-C5a樣基因,根據(jù) EST序列結(jié)合 RACE方法從鯉(Cyprinus carpi

5、o)脾臟中克隆了該基因的全長(zhǎng) cDNA序列(GenBank登錄號(hào):JQ026408)。該序列全長(zhǎng)830 bp,5端非翻譯區(qū)174 bp,3端非翻譯區(qū)296 bp,開放閱讀框360 bp,編碼一個(gè)由119個(gè)氨基酸組成的蛋白。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),該蛋白質(zhì)含有分泌信號(hào)肽和保守的趨化因子結(jié)構(gòu)域;GO注釋發(fā)現(xiàn)該基因參與免疫細(xì)胞遷移的生物學(xué)過(guò)程。CCL-C5a基因在鯉10個(gè)組織中表達(dá),其中在脾和肝的表達(dá)量最高。脂多糖刺激鯉外周血白細(xì)胞和頭腎白細(xì)胞后,該

6、基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著上升。氨基酸序列保守性分析表明鯉 CCL-C5a樣趨化因子與斑馬魚(Danio rerio)的同源性最高,為61％,與藍(lán)鯰(Ictalurus furcatus)、溝鯰(Ictalurus punctatus)和大西洋鮭(Salmo salar)的同源性分別為47%、47%和42%;與人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性為37%。適應(yīng)性進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)鯉與斑馬魚 CCL-C5a的Ka/Ks小于1,說(shuō)明 CC

7、L-C5a基因在魚類的進(jìn)化過(guò)程受到負(fù)選擇壓作用。
　　結(jié)論:本研究對(duì)鯉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行混合裝配得到的鯉重疊群,方便我們對(duì)鯉第四輪基因組復(fù)制的時(shí)間進(jìn)行估計(jì);本研究建立的數(shù)據(jù)資源將有利于今后功能基因組和基因組注釋的研究。此外,對(duì)鯉 CC型趨化因子 CCL-C5a樣基因進(jìn)行了全長(zhǎng)cDNA克隆,分析了該基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能,研究了該基因的組織表達(dá)特點(diǎn)和進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明,鯉 CCL-C5a主要在免疫器官上高表達(dá),并受到脂多糖誘導(dǎo)表達(dá)上升;