柚果實(shí)采后貯藏期間有機(jī)酸代謝的研究.pdf

1、有機(jī)酸是影響柑橘果實(shí)風(fēng)味的重要因素之一，在貯藏期間，高濃度的有機(jī)酸對(duì)于果實(shí)保鮮極為重要。柚（Citrus grandis）是我國(guó)廣泛栽培的重要柑橘類型之一，因其優(yōu)良的貯藏性能和獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)備受消費(fèi)者青睞。本研究以我國(guó)主栽的柚品種果實(shí)為研究對(duì)象，對(duì)其果實(shí)采后貯藏期間果皮和果肉組織中有機(jī)酸和可溶性糖濃度的變化進(jìn)行分析;并從生理生化、基因表達(dá)、代謝物分析等方面著重對(duì)HB柚[Hirado Butun Pumelo(Citrus grandis

2、)]采后貯藏期間有機(jī)酸代謝以及有機(jī)酸與果實(shí)衰老之間的聯(lián)系進(jìn)行研究，獲得的主要結(jié)論如下:
　　 1、建立了基于高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定柑橘果實(shí)中有機(jī)酸濃度的技術(shù)體系。通過(guò)對(duì)緩沖溶液、電滲流改性劑、分離電壓和檢測(cè)波長(zhǎng)等電泳條件的優(yōu)化，精確地測(cè)定了柚果肉中4種重要有機(jī)酸（檸檬酸、蘋果酸、烏頭酸和延胡索酸）的濃度。優(yōu)化參數(shù)如下:100mM磷酸鹽緩沖溶液(0.5 mM CTAB，pH7.0)，0.5 psi(pounds persquare

3、inch，壓強(qiáng)單位)進(jìn)樣3 sec，分離電壓12kV，分離溫度20℃，檢測(cè)波長(zhǎng)200nm。
　　 2、揭示了采后貯藏期間，沙田柚、珀溪蜜柚、HB柚、無(wú)酸柚和南康甜柚果肉中有機(jī)酸濃度的變化。結(jié)果顯示，無(wú)論哪一個(gè)柚品種，有機(jī)酸濃度均伴隨著波動(dòng)變化，而并非簡(jiǎn)單的降低。HB柚果肉中有機(jī)酸濃度呈現(xiàn)出明顯的波動(dòng)特性，在78 DOS(days of storage)時(shí)出現(xiàn)一個(gè)有機(jī)酸濃度的峰值，隨后整體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。此外，實(shí)驗(yàn)中也測(cè)

4、定了沙田柚、瑁溪蜜柚和HB柚在低溫（8-10℃）貯藏條件下果肉中有機(jī)酸濃度的變化。沙田柚和HB柚果肉中有機(jī)酸濃度的變化趨勢(shì)不受貯藏溫度的影響，珀溪蜜柚果肉中有機(jī)酸濃度在室溫(16-20℃)和低溫(8-10℃)貯藏條件下，呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。
　　 3、揭示了采后貯藏期間，沙田柚、琯溪蜜柚和HB柚果實(shí)的不同組織中有機(jī)酸和可溶性糖濃度的變化。結(jié)果顯示，沙田柚和HB柚果肉中有機(jī)酸濃度的變化趨勢(shì)基本相似，有機(jī)酸濃度在整體下降的過(guò)程中出

5、現(xiàn)一個(gè)暫時(shí)的峰值，且4種有機(jī)酸濃度的變化趨勢(shì)基本一致;琯溪蜜柚果肉中檸檬酸的濃度在貯藏期間呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，蘋果酸、烏頭酸和延胡索酸則不同程度地降低。柚果皮（白皮層和黃皮層）中均以奎寧酸為主，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各有機(jī)酸濃度均呈現(xiàn)降低趨勢(shì);三種可溶性糖的濃度也呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。
　　 4、HB柚采后貯藏期間有機(jī)酸代謝機(jī)制研究生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)HB柚果實(shí)采后存在“返酸”現(xiàn)象。前期的研究證實(shí)，HB柚在采后貯藏期間有機(jī)酸濃度整體上呈現(xiàn)出先升高后

6、降低的變化趨勢(shì)，且存在一個(gè)有機(jī)酸濃度明顯高于貯藏初期的時(shí)期。因此，我們選取HB柚為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其采后貯藏期間有機(jī)酸代謝機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　 (1)利用毛細(xì)管電泳技術(shù)精確地測(cè)定了HB柚在采后貯藏期間果肉中有機(jī)酸的濃度。三年的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HB柚在采后貯藏期間，有機(jī)酸濃度呈現(xiàn)規(guī)律的波動(dòng)變化，且在變化過(guò)程中存在一個(gè)有機(jī)酸濃度顯著高于貯藏初期的峰值，進(jìn)一步研究表明，貯藏溫度和采后果實(shí)自身的呼吸作用不是引起果肉中有機(jī)酸濃度波動(dòng)變化的關(guān)

7、鍵因素。
　　 (2)通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證已開(kāi)發(fā)的細(xì)胞器表達(dá)譜芯片中的部分差異表達(dá)基因。果肉中檸檬酸的濃度與直接參與檸檬酸合成和代謝的酶（檸檬酸合成酶和烏頭酸酶）基因表達(dá)之間不存在任何相關(guān)性。我們從芯片結(jié)果中篩選得到4個(gè)參與不同蘋果酸代謝途徑的酶基因，然而，除了過(guò)氧化酶體中的蘋果酸脫氫酶基因表達(dá)與蘋果酸濃度呈現(xiàn)高度的負(fù)相關(guān)外，其它3個(gè)基因均未呈現(xiàn)任何相關(guān)性，由此推測(cè)，乙醛酸循環(huán)可能在HB柚果實(shí)采后貯藏期間有機(jī)酸代謝中起到了重要

8、的作用。
　　 (3) GC/MS測(cè)定結(jié)果顯示，2-酮戊二酸的含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，琥珀酸的含量顯著增加，然而，琥珀酸脫氫酶和2-酮戊二酸脫氫酶基因表達(dá)則沒(méi)有顯示出有利于琥珀酸積累的變化趨勢(shì)。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和谷氨酰胺的含量在果實(shí)采后貯藏期間呈現(xiàn)出相似的上升趨勢(shì)，且正相關(guān)于琥珀酸的含量，負(fù)相關(guān)于2-酮戊二酸的含量。因此，我們推測(cè)HB柚果實(shí)在采后貯藏期間

9、，除了TCA循環(huán)，可能還有其它的代謝路徑參與了有機(jī)酸的利用。
　　 (4)為了進(jìn)一步研究HB柚在采后貯藏期間果實(shí)內(nèi)部衰老的變化，本研究測(cè)定了果肉中ATP和H2O2的含量，以及抗氧化酶（過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶）的活性。結(jié)果顯示，HB柚果肉中ATP的含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且變化趨勢(shì)正相關(guān)于有機(jī)酸濃度。H2O2的含量呈現(xiàn)小幅波動(dòng)變化，整體上呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此外，分析發(fā)現(xiàn)2種抗氧化酶的活性均與H2O2含量以及有機(jī)酸濃度成正相關(guān)

10、。本研究發(fā)現(xiàn)HB柚果肉中線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的開(kāi)放程度隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加，這表明線粒體膜的損傷程度加劇。
　　 綜上所述，不同的柚品種因其遺傳背景不同，在貯藏期間有機(jī)酸濃度變化趨勢(shì)出現(xiàn)差異，而同一柚品種的不同組織中有機(jī)酸種類和濃度也表現(xiàn)出很強(qiáng)的組織特異性。HB柚在采后貯藏期間，存在于有機(jī)酸濃度變化中的波動(dòng)現(xiàn)象在部分細(xì)胞器中的基因表達(dá)以及代謝物含量變化中也有發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明該現(xiàn)象是柑橘類果實(shí)采后生命活動(dòng)固有的特性，隨