StPP2C和StABF對(duì)馬鈴薯塊莖形成的影響.pdf

1、塊莖是馬鈴薯的繁殖器官，也是重要的產(chǎn)品器官。馬鈴薯塊莖形成受到光周期、蔗糖、溫度、激素等因素影響，并且與馬鈴薯塊莖形成相關(guān)的基因眾多。本實(shí)驗(yàn)室通過RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)篩選到在蔗糖及光周期處理下差異表達(dá)的基因，但是這些基因在馬鈴薯塊莖形成過程中所發(fā)揮的作用還尚未明確。本研究從馬鈴薯品系E26中克隆了4個(gè)對(duì)光周期或蔗糖響應(yīng)的StPP2C以及對(duì)光周期響應(yīng)的StABF，并利用基因表達(dá)譜和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)初步分析了StPP2C及StABF

2、與馬鈴薯試管薯形成的關(guān)系，從而探究其在塊莖形成中的作用。主要結(jié)果如下:
　　1.通過RT-qPCR方法從8個(gè)差異表達(dá)的StPP2C基因中篩選到了4個(gè)StPP2C基因，另外還篩選到1個(gè)StABF基因，其中StPP2C1、StPP2C4響應(yīng)蔗糖，StPP2C6、StPP2C7、StABF響應(yīng)光周期。擴(kuò)增獲得了5個(gè)基因的全長開放閱讀框(ORF)，片段大小均為1200bp左右。聚類分析結(jié)果顯示，受蔗糖和光周期誘導(dǎo)的StPP2C基因分別具有

3、較近的親緣關(guān)系。
　　2.為了分析StPP2C1、StPPC4及StABF對(duì)蔗糖的具體響應(yīng)情況，將E26試管苗在2％蔗糖下培養(yǎng)3周后分別加入2％與10％蔗糖的液體MS培養(yǎng)基培養(yǎng)5天，第一天每4小時(shí)取樣，其后每1天取樣以測(cè)定三者的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，StPP2C1和StPP2C4在蔗糖處理4小時(shí)高濃度蔗糖（8％蔗糖）中基因的表達(dá)量明顯高于低蔗糖濃度（2％蔗糖），達(dá)到4倍以上，并且其表達(dá)差異最大都達(dá)到了25倍，StPP2C1的差異峰值

4、出現(xiàn)在處理1天，而StPP2C4出現(xiàn)在處理20小時(shí)。處理1天之后，8％蔗糖和2％蔗糖處理下的基因表達(dá)量仍表現(xiàn)出明顯的差異，但兩者的表達(dá)量均有一定的降低，說明這兩個(gè)基因?qū)φ崽菨舛软憫?yīng)并且早期更加明顯。StABF基因在處理1天內(nèi)8％蔗糖下的表達(dá)量明顯高于2％蔗糖下的表達(dá)量，最高達(dá)到了15倍，但是1天后，兩者濃度處理下StABF基因的表達(dá)量差異沒有達(dá)到兩倍以上，因此，我們認(rèn)為StABF基因在早期時(shí)對(duì)蔗糖響應(yīng)。
　　3.為了分析StPP2

5、C6、StPP2C7和StABF對(duì)光周期的具體響應(yīng)情況，將E26試管苗在長日照條件下（16h光照/d）培養(yǎng)3周后分別轉(zhuǎn)入到長日照和短日照(8h光照/d)培養(yǎng)2天，期間每4小時(shí)取樣測(cè)定各基因表達(dá)水平。StPP2C6和StPP2C7均表現(xiàn)出了一定的節(jié)律性，StPP2C6在短日照(SD)處理8小時(shí)，此時(shí)剛好進(jìn)入黑暗其表達(dá)量開始上升，在SD處理16小時(shí)達(dá)到了最高值，而后表達(dá)量逐漸降低但是波動(dòng)不是很明顯;StPP2C7在長日照(LD)下進(jìn)入黑暗時(shí)

6、表達(dá)量都是升高的，而在短日照下，在進(jìn)入黑暗后前8個(gè)小時(shí)表達(dá)量逐漸升高而在后8個(gè)小時(shí)表達(dá)量又回落。StABF表現(xiàn)出較明顯的光周期節(jié)律性，LD條件下，光照時(shí)StABF的表達(dá)量升高，進(jìn)入黑暗后表達(dá)量逐漸降低;SD條件下，光照時(shí)StABF的表達(dá)量逐漸升高，到進(jìn)入黑暗12小時(shí)后開始下降，并且兩天的表達(dá)趨勢(shì)是一致的。
　　4.為了研究StPP2C是否存在體外活性，本研究構(gòu)建了StPP2C基因體外表達(dá)載體PP2C-GEX，進(jìn)行體外表達(dá)和純化，并

7、且測(cè)定了蛋白磷酸酶2C的體外活性。結(jié)果顯示，StPP2C1、StPP2C4、StPP2C6、StPP2C7分別使底物析出游離磷為2.21nmol、1.05nmol、1.22nmol、2.62nmol，證明了StPP2C基因具有蛋白磷酸酶2C活性。
　　5.為了研究StPP2C基因的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了StPP2C基因的綠色熒光蛋白(GFP)融合載體。結(jié)果顯示，StPP2C1基因主要定位在細(xì)胞膜，StPP2C4基因主要定位在細(xì)胞核，S

8、tPP2C6與StPP2C7基因的定位尚未完成。
　　6.為了分析StPP2C、StABF與位于同一ABA信號(hào)途徑上的蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶(SnRK1)是否存在互作，構(gòu)建了PP2C-GBK與ABF-GBK載體，采用酵母雙雜交的方法證明了StPP2C6、StABF與SnRK1存在互作。
　　7.為了研究4個(gè)StPP2C基因和1個(gè)StABF基因?qū)︸R鈴薯試管薯形成的影響，構(gòu)建了組成型啟動(dòng)子CaMV35S驅(qū)動(dòng)的StPP2C和

9、StABF RNAi干涉載體，以鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)為受體進(jìn)行馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了68個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性株系。經(jīng)RT-qPCR分析，所干涉基因在各轉(zhuǎn)基因株系中都呈現(xiàn)出不同程度的下調(diào)表達(dá)，干涉效率最高達(dá)到了99％。對(duì)每個(gè)干涉載體選取的6株轉(zhuǎn)基因株系和E3分別進(jìn)行光周期處理和蔗糖處理，之后進(jìn)行結(jié)薯統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，StPP2C1、StPP2C4干涉株系與E3相比，其單株結(jié)薯數(shù)和單薯重都有所降低，兩者在2％、4％和8％蔗糖濃度下，單株結(jié)薯數(shù)和單薯重