Patatin SK24-1基因?qū)︸R鈴薯塊莖發(fā)育的影響.pdf

1、Patatin是馬鈴薯塊莖內(nèi)主要的貯藏蛋白，patatin與一般塊莖貯藏蛋白相比，具有酯酰水解酶（Lipid acylhydrolase，LAH）和抗氧化性的活性。研究發(fā)現(xiàn)patatin的LAH活性能夠非特異性的催化多種?；愃?，當植株受到病害或蟲害時，patatin會大量表達從而引發(fā)植株發(fā)生防衛(wèi)反應;patatin具有抗氧化和抗自由基的活性，能夠清除自由基、抑制羥基自由基介導的DNA損傷;此外，patatin基因家族部分成員的表達

2、，能夠增加植株的耐受性。
　　 在此之前，本實驗室克隆到了patatin基因家族的一員，命名為SK24-1，通過馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化初步證實了SK24-1基因的表達能夠影響塊莖的形成。通過ELISA測定了塊莖形成過程中激素含量的變化，推測塊莖的形成可能與茉莉酸(JA)與赤霉素(GA3)的平衡有關。并且，patatin家族的大多數(shù)成員都具有酯酰水解酶的活性，SK24-1基因是否也具有酯酰水解酶的活性，從而參與茉莉酸的合成，影響塊莖的發(fā)

3、育呢？至今還沒有明確的定論。
　　 在前期研究的基礎上，本實驗旨在闡明SK24-1基因在塊莖形成過程中的作用機制。圍繞著這個目標，首先將SK24-1基因在體外誘導表達、純化后進行LAH酶活性的測定，證明了SK24-1基因具有酯酰水解酶活性。以鄂馬鈴薯3號試管薯為受體材料，進行馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了超量表達SK24-1基因、干涉SK24-1基因和干涉patatin基因家族的轉(zhuǎn)基因株系，對轉(zhuǎn)基因株系內(nèi)源MeJA、GA3含量、LAH

4、活性、結(jié)薯狀況的變化進行了測定。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建了SK24-1基因體外表達載體pGEX-SK24-1，將SK24-1基因在體外表達和純化后進行酯酰水解酶活性的測定，三次獨立重復實驗都證明了SK24-1基因具有酯酰水解酶的活性，比活U(U/min·mg protein)=73.228。
　　 2.構(gòu)建了組成型啟動子CaMV35S驅(qū)動的RNAi SK24-1基因（pHellsgate-SK24-1）和RNA

5、i基因家族的干涉載體(pHellsgate-patatin)。以品種鄂馬鈴薯3號(E3)為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得了超量表達SK24-1基因的轉(zhuǎn)基因株系22株，SK24-1基因RNAi轉(zhuǎn)基因株系13株，patatin基因家族的RNAi轉(zhuǎn)基因株系15株。
　　 3.經(jīng)RT-qPCR分析，超量表達SK24-1基因的各個轉(zhuǎn)基因株系基因表達量與E3相比明顯的上調(diào)的表達;干涉SK24-1的轉(zhuǎn)基因株系僅獲得一株基因表達量有所下降的株系（SK

6、24-1-Ri-E3-14），有7株與E3相比有十分明顯的上調(diào)表達;干涉patatin基因家族的轉(zhuǎn)基因株系其基因表達量明顯下調(diào)，部分轉(zhuǎn)基因株系生長受到了影響，生長遲緩，植株細弱。
　　 4.對植株內(nèi)源激素MeJA和GA3的測定發(fā)現(xiàn)，超量表達SK24-1基因能夠提高塊莖形成過程中MeJA的合成水平。與E3相比，超表達株系MeJA/GA3的比值在2周、3周時明顯高于E3;干涉SK24-1單基因，則對茉莉酸的合成水平?jīng)]有造成明顯的影響

7、;干涉patatin家族后植株體內(nèi)茉莉酸的合成水平變化較大，但是沒有明顯的變化規(guī)律。
　　 5.提取植株粗蛋白進行LAH活性的測定發(fā)現(xiàn)，與E3相比，超表達株系LAH活性有所上升，而干涉SK24-1基因和patatin家族則對植株LAH活性沒有明顯的影響。
　　 6.對轉(zhuǎn)基因植株和E3進行了結(jié)薯情況的觀察和統(tǒng)計，超表達SK24-1基因的轉(zhuǎn)基因株系在結(jié)薯數(shù)目、結(jié)薯株率、單株結(jié)薯率和平均薯重上與E3相比都有明顯的增高;干涉SK

8、24-1單基因的株系結(jié)薯情況與E3相比沒有顯著的變化;干涉patatin家族的株系結(jié)薯顯著下降。與E3相比，所有的轉(zhuǎn)基因株系結(jié)薯時間都明顯的提早。
　　 7.回歸分析可知，SK24-1基因的導入與敲除，影響了馬鈴薯植株內(nèi)MeJA/GA3的平衡，進一步影響了塊莖的形成;其所引起的內(nèi)源MeJA含量的改變對塊莖形成影響較小;植株LAH活性發(fā)生變化，且LAH活性與塊莖形成高度相關，LAH活性的改變影響了MeJA的生物合成，但是低度相關，