抑制馬鈴薯Acid Invertase基因表達對塊莖淀粉-糖代謝的影響研究.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，用途廣泛，其加工產品炸片和炸條是重要的油炸食品。為了抑制常溫貯藏產生的塊莖失水皺縮、病害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長加工周期，通常將馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下。但低溫常使塊莖中的淀粉加速轉化為還原糖，高溫油炸加工時，還原糖與塊莖中游離的氨基酸發(fā)生褐化反應，嚴重影響油炸產品的色澤和品質，甚至對人體健康產生不良影響。因此，控制“低溫糖化”已經成為馬鈴薯采后生理學研究的熱點。塊莖“低溫糖化”是個復雜的數(shù)量性狀，涉及淀粉.

2、糖代謝的多種路徑，調節(jié)和反饋因子多，因此“低溫糖化”的機理研究是馬鈴薯加工品質改良的重要基礎工作。在植物體內，蔗糖降解只有兩個途徑：蔗糖合成酶途徑和轉化酶途徑。轉化酶，又稱蔗糖轉化酶，可分為中性(或堿性)轉化酶和酸性轉化酶，其中，酸性轉化酶又包括液泡轉化酶和胞壁轉化酶。前人的研究表明，酸性轉化酶活性與還原糖/蔗糖比率成顯著正相關，從而成為淀粉一糖代謝中的關鍵酶之一。因此，進一步明確轉化酶在調控馬鈴薯低溫糖化過程中的作用，對于馬鈴薯淀粉一

3、糖代謝的調控進而提高馬鈴薯低溫貯藏下的加工品質具有重要的理論和實踐意義。 本研究旨在克隆馬鈴薯內源酸性轉化酶基因，并通過構建組成型啟動子CaMV35S和塊莖特異表達啟動子CIPP驅動的反義基因(或片段)載體以及RNA干涉載體轉化馬鈴薯，對內源酸性轉化酶基因的表達進行調控，進一步明確其在淀粉一糖代謝過程中的作用，揭示酸性轉化酶在調控馬鈴薯低溫糖化中的關系。主要結果如下： 1.以發(fā)表的酸性轉化酶基因的序列設計引物，采用RT-

4、PCR的方法，從低溫處理的馬鈴薯品系JH塊莖eDNA中克隆到全長為1920bp的特異條帶，DNA序列測定結果顯示，目標片段為inv的完整的編碼序列，為一個開放讀碼框，編碼639個氨基酸。Blasm結果顯示，該片段與已知的酸性inv基因cDNAS70040(番茄)以及液泡轉化酶cDNA X70368.1(馬鈴薯)、Z12025(番茄)和Z12026(醋栗番茄)的同源性分別達到95％，98％，96％和96％。其中，Expasy蛋白結構預測的

5、結果顯示，氨基酸序列的34到56有一個跨膜結構域KIISGIFLSSFLLSVAFFPILN，同時，在N端1-49存在一個信號結構，在614的位置存在一個蛋白剪切位點GAS，120-124和299-303為inv基因的兩個保守位點NDPNG和WECVD，在靠近N端的序列中還存在幾處糖基化位點。上述結果初步證明，所克隆的cDNA為馬鈴薯液泡轉化酶基因，該序列已經在GenBank注冊，登記號為AY341425。 2.通過PCR.擴增

6、和限制酶切，將克隆的cDNA分為靠近5’端(397bp)，包含有保守位點的中間區(qū)段(625bp)以及靠近3’端(955bp)的三個片段。四個片段(包括全長)分別與35S和CIPP啟動子構建成反義載體轉化馬鈴薯。對轉基因塊莖進行低溫貯藏(設置常溫貯藏對照)后測定酸性轉化酶活性和還原糖含量，結果顯示，不同插入片段大小對酶活性和還原糖含量的影響沒有顯著差異。其中，35S啟動子的轉基因株系中，低溫(4℃)貯藏下，酸性轉化酶活性2005年的平均下

7、降幅度從為29％-47％，2006年平均降幅為10％-13％；還原糖含量2005年的平均降幅為19％-26％，2006年為29％-34％。室溫(20℃)貯藏下，2005年的酸性Inv活性降幅均在60％以上，但還原糖含量變化不大；而2006年的還原糖含量下降均達到30％以上，酸性Inv活性無顯著變化。兩類啟動子轉基因株系的抑制效率存在顯著差異。4℃貯藏條件下，CIPP啟動子驅動的轉基因植株的酶活性下降53％(貯藏6周)和21％(貯藏10周

8、)，還原糖含量下降35％(貯藏6周)和67％(貯藏10周)；但是室溫貯藏條件下，不同啟動子的轉基因株系的平均酶活和還原糖含量都沒有明顯差異。試驗結果證明，所使用的cDNA片段均能達到相似的反義抑制效果。而采用塊莖特異表達的CIPP啟動子的轉化植株，其塊莖的酸性轉化酶活性和還原糖含量在低溫貯藏下的抑制效果均優(yōu)于組成型表達的35S啟動子。 3.研究還構建了RNA干涉載體并轉化馬鈴薯，并對轉基因植株和試管薯進行酸性轉化酶活性的測定。結

9、果表明，在測定的5個株系中，植株的酸性轉化酶活性均有不同程度的下降，其中除Ni-1外，酶活下降均在65％以上，最大降幅為78％(Ni-4)，平均下降59.3％。而同時測定的抑制效果較好的反義轉基因株系中，酸性轉化酶活性最大降幅為84％(ES4-3)，平均下降58.4％，表明RNAi技術在馬鈴薯抗“低溫糖化”基因工程中也同樣具有較好的應用潛力。 4.Northern分析表明，轉基因植株和塊莖中反義RNA的表達量在不同的啟動子之間存

10、在一定的差異，其中，35S啟動子所驅動的株系在植株和塊莖中均有強烈的表達，CIPP啟動子所驅動的株系只在塊莖中呈現(xiàn)強烈的表達，而在植株的表達幾乎沒有，也再次證實了CIPP啟動子的塊莖特異性。RNA干涉的轉基因植株中內源酸性轉化酶的mRNA表達量也明顯降低。Northern分析進一步說明酸性轉化酶的反義抑制和RNA干涉顯著降低了植株內源酸性轉化酶的mRNA的表達，證明Invertase可能主要在轉錄后水平上調控塊莖低溫糖化。 5.

11、對抑制效果較好的株系進行塊莖低溫貯藏以后，測定了其蔗糖和淀粉含量。結果表明，在低溫貯藏(4℃)條件下，株系ES4-3的抑制效率達到最高，酸性轉化酶活性降低了72％，還原糖含量下降了68.7％，同時引起蔗糖含量的上升(含量增加92.4％)和淀粉的積累(淀粉含量增加7.2％)。同時，EC4-5和EC19-5的酸性轉化酶活性也分別表現(xiàn)出33.4％和23.9％的下降，還原糖含量分別下降8.69％和69.5％，從而導致蔗糖含量分別增加了7.6％和

12、12.2％?？傮w上，轉基因株系中酸性轉化酶活性和還原糖含量的大量變化能夠引起蔗糖分解顯著降低，但對淀粉的合成并沒有明顯的促進。在室溫貯藏(20℃)條件下，除個別株系(EC4-5)外，各測定指標變化不大。證明低溫導致的塊莖還原糖積累可能主要來自于蔗糖分解途徑，而不是淀粉降解。 6.選取測定結果較好的轉基因塊莖及其非轉基因對照和加工品種對照，低溫貯藏后進行炸片試驗。結果顯示，轉基因塊莖的炸片色澤指數(shù)較非轉基因對照均有所降低，同一株系