RNAi抑制HIF-1α表達對腫瘤糖代謝影響的實驗研究.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 HIF-1α在胃癌及胰腺癌中的表達
　　目的：研究 HIF-1α在胃癌和胰腺癌組織中的表達以及與臨床病理之間的關(guān)系。
　　方法：通過免疫組織化學和Western Blot的方法檢測50例胃癌和50例胰腺癌組織中HIF-1α蛋白的表達;通過Realtime PCR的方法檢測HIF-1α mRNA在胃癌和胰腺癌組織中的表達，并分析HIF-1α的表達與胃癌和胰腺癌臨床病理之間的關(guān)系

2、。
　　結(jié)果：HIF-1αmRNA和蛋白在胃癌和胰腺癌組織中均存在高表達，與癌旁正常組織相比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。胃癌組織中HIF-1α的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān);胰腺癌組織中HIF-1α的表達與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　結(jié)論：HIF-1α在胃癌及胰腺癌組織中均存在著高表達。HIF-1α的表達與胃癌和胰腺癌的病理分期有關(guān)。
　　第二部分 RNAi抑制HIF-1α表達對胰腺

3、癌細胞及糖代謝影響的體外實驗
　　第一節(jié) HIF-1α基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建針對HIF-1α基因表達的RNA干擾靶向沉默慢病毒載體。
　　方法：針對HIF-1α基因核苷酸序列設(shè)計干擾片段，和載體連接構(gòu)建shRNA表達質(zhì)粒，進行酶切鑒定和陽性克隆質(zhì)粒測序，隨后通過慢病毒載體感染胰腺癌BxPC-3細胞，進行感染效率測定，最后利用定量PCR和Western Blot方法鑒定目的基因表達。
　　結(jié)果

4、：酶切簽定、陽性克隆質(zhì)粒測序、定量PCR和Western Blot測定HIF-1α表達結(jié)果說明該RNAi慢病毒載體對目的基因具有較好的干擾效果。
　　結(jié)論：靶向HIF-1α基因的RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。
　　第二節(jié) HIF-1α基因沉默對胰腺癌BxPC-3細胞及糖代謝影響的體外實驗
　　目的：探討HIF-1α基因沉默對胰腺癌細胞生長、侵襲和凋亡的影響;探討HIF-1α對胰腺癌細胞糖代謝的調(diào)控作用。
　　方法：

5、實驗分干擾組、GFP對照組、空白對照組，分別進行兩種處理:正常培養(yǎng)、缺氧培養(yǎng)。利用MTT實驗繪制胰腺癌細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Transwll實驗檢測細胞侵襲;利用乳酸試劑盒測定乳酸含量;利用定量PCR和Weste Blot方法測定PDK1、LDHA、PKM2和CS的表達，觀察HIF-1α沉默前后相關(guān)檢測指標的變化。
　　結(jié)果：缺氧條件下，HIF-1α mRNA和蛋白的表達均明顯升高，乳酸的生成、糖代謝酶PDK1、L

6、DHA、PKM2 mRNA和蛋白的表達均明顯升高，同有氧條件下比較，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); CS mRNA和蛋白的表達同有氧條件下比較，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。缺氧條件下，HIF-1α基因沉默后，乳酸的生成、糖代謝酶PDK1、LDHA、PKM2 mRNA和蛋白的表達均受到明顯抑制，與空載體組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); CS mRNA和蛋白的表達沒有受到明顯影響，與空載體組比較，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0

7、.05)。缺氧條件下，HIF-1α基因沉默后，胰腺癌BxPC-3細胞的生長受到抑制，凋亡率升高，細胞侵襲受到抑制，同空載體組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論：在缺氧條件下，HIF-1α的表達明顯增強，它可能通過上調(diào)其下游糖酵解相關(guān)酶的表達，增強腫瘤的糖酵解代謝;HIF-1α沉默在體外能抑制胰腺癌BxPC-3細胞的生長和侵襲，使其凋亡率升高。
　　第三部分 RNAi抑制HIF-1α表達裸鼠成瘤的體內(nèi)實驗