HIF-1α和HIF-2α在小細胞肺癌腫瘤干細胞和腫瘤組織中表達的研究.pdf

1、研究目的
　　 1.研究小細胞肺癌細胞系腫瘤干細胞中HIFs有無表達及其意義。
　　 2.研究小細胞肺癌腫瘤組織中HIFs的表達及其臨床病理意義。
　　 研究方法
　　 1.利用干細胞無血清培養(yǎng)技術(shù)，富集小細胞肺癌細胞系H446第三代腫瘤球細胞作為腫瘤干細胞。
　　 2.采用實時熒光定量PCR方法，檢測小細胞肺癌細胞系H446腫瘤球細胞和親代細胞中HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達。

2、　　 3.進一步采用實時熒光定量PCR方法，檢測HIF-2α調(diào)控的靶基因OCT-4及其它干細胞相關(guān)基因SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表達。
　　 4.采用免疫熒光染色方法，檢測小細胞肺癌細胞系H446腫瘤球細胞和親代細胞中HIF-1α、HIF-2α和OCT-4的蛋白表達。
　　 5.通過免疫組化染色方法，檢測45例小細胞肺癌組織中HIF-1α和HIF-2α的表達并分析其臨床病理意義。
　　 6.采用

3、Spearman秩相關(guān)方法，分析HIF-1α和HIF-2α的表達與小細胞肺癌干細胞標(biāo)記物uPAR的相關(guān)性。
　　 7.采用Kaplan-Meier方法進行單因素分析，再將單因素回歸分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進行Cox比例風(fēng)險回歸模型的多因素分析。
　　 結(jié)果
　　 1.小細胞肺癌腫瘤干細胞中HIF-1α和HIF-2α的表達
　　 (1)本課題組前期工作證明小細胞肺癌細胞系H446第三代腫瘤球細胞富集腫瘤干細

4、胞，本研究以第三代腫瘤球細胞作為腫瘤干細胞。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示:與親代細胞相比，腫瘤球細胞HIF-2α的mRNA表達水平上調(diào)(P＜0.05)，相反，HIF-1α的mRNA表達水平下調(diào)（P＜0.05），提示HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達水平呈互補特征。
　　 (2)進一步檢測HIF-2α的靶基因OCT-4及干細胞相關(guān)基因在腫瘤球細胞中的表達，結(jié)果顯示:與親代細胞相比，腫瘤球細胞OCT-4的mRNA表達水平上調(diào)(P

5、＜0.05)，而SOX2、c-Myc和NONOG的mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (3)免疫熒光染色結(jié)果顯示:腫瘤球細胞中，HIF-2α呈現(xiàn)陽性表達，而HIF-1α呈弱陽表達甚至陰性;相反，親代細胞中，HIF-2α呈弱陽表達甚至陰性，而HIF-1α呈陽性表達，提示HIF-1α和HIF-2α的蛋白表達也呈互補特征。
　　 2.小細胞肺癌腫瘤組織中HIF-1α和HIF-2α的表達及其臨床意義

6、　　 (1)小細胞肺癌腫瘤組織中HIF-1α的陽性表達率為48.9％(22/45)，癌旁正常組織中無HIF-1α表達;HIF-1α陽性表達產(chǎn)物主要定位于腫瘤細胞胞核，陽性細胞散在分布于癌巢。HIF-2α的陽性表達率為24.4％(11/45)，癌旁正常組織中無HIF-2α表達;HIF-2α陽性表達產(chǎn)物主要定位于腫瘤細胞胞核，陽性細胞主要分布于腫瘤壞死組織周圍區(qū)域。腫瘤間質(zhì)細胞中，一小部分形態(tài)上確定為腫瘤相關(guān)巨噬細胞中亦可見HIF-2α表

7、達。
　　 (2) HIF-1α和HIF-2α的表達與小細胞肺癌干細胞標(biāo)記物uPAR（前期研究結(jié)果）的Spearman相關(guān)分析顯示:HIF-1α與uPAR表達無相關(guān)性(P=0.183，r=0.202)，但HIF-2α與uPAR的表達呈顯著正相關(guān)(P=0.001，r=0.497)。為了進一步弄清HIF-2α和uPAR在小細胞肺癌組織的表達定位是否也具相關(guān)性，我們進行HIF-2α和uPAR的免疫組化連續(xù)切片染色，結(jié)果顯示:HIF-2

8、α與uPAR在某種程度上共同表達于小細胞肺癌組織壞死周圍區(qū)域，盡管HIF-2α陽性細胞與uPAR陽性細胞沒有完全重疊。
　　 (3) HIF-2α的表達與小細胞肺癌腫瘤大小和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān):隨著腫瘤體積的增大，HIF-2α的表達隨之增高（P＜0.05），HIF-2α陽性組患者遠處轉(zhuǎn)移率高于HIF-2α陰性組（P＜0.05）。但是HIF-1α的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵襲和遠處轉(zhuǎn)移無明確統(tǒng)計學(xué)意義(P＞

9、0.05)。
　　 (4)單因素分析結(jié)果顯示小細胞肺癌患者生存時間縮短與HIF-1α、HIF-2α、年齡和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。但將單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進行多因素分析，結(jié)果表明只有HIF-2α和遠處轉(zhuǎn)移能作為小細胞肺癌獨立預(yù)后因素。
　　 結(jié)論
　　 1.小細胞肺癌細胞系H446腫瘤干細胞中HIF-1α和HIF-2α均有表達，但HIF-2α表達水平上調(diào)，HIF-1α表達水平反而下調(diào)，提示兩者的表達呈互補特征。<