HIF-1α調(diào)控TAZ和GLS2對維持腫瘤干細胞表型及介導腫瘤放療耐受的機制研究.pdf

1、原發(fā)腫瘤中有極小一群腫瘤細胞具有自我更新能力，腫瘤形成能力以及多向分化潛能，在促使腫瘤形成和維持其增殖，以及導致腫瘤轉(zhuǎn)移復發(fā)中起必不可少的作用，這部分細胞被稱為腫瘤干細胞(CSCs)?，F(xiàn)在已有大量文獻報道在很多不同類型的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的存在，而缺氧環(huán)境下HIF1的活化則可上調(diào)腫瘤干細胞的數(shù)量以及維持其表型，然而，其中的調(diào)控機制卻仍不清楚。最近有文獻報道，Hippo信號通路的效應(yīng)因子名為具有PDZ結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)

2、對乳腺癌干細胞的自我更新以及腫瘤形成發(fā)揮關(guān)鍵作用。TAZ在大于80％的晚期乳腺癌病人中高表達，但研究表明TAZ編碼基因WWTR1在乳腺癌中的擴增不到10％，提示可能有其他調(diào)控機制參與其中。與此同時，我們發(fā)現(xiàn)HIF的靶基因與TAZ下游調(diào)控基因有非常高的重合率，這提示我們HIF與TAZ之間可能存在密切的相互調(diào)控關(guān)系。
　　代謝方式的適應(yīng)性改變是腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中的顯著特征之一。許多參與調(diào)節(jié)細胞代謝的癌基因在這一過程中活化，導致腫瘤細

3、胞發(fā)生代謝方式的改變，以幫助它們適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境（如放射線和化學藥物治療），然而除代謝調(diào)控基因以外，放化療也可活化HIF-1的表達。HIF-1的表達激活下游基因葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)和丙酮酸脫氫酶激酶1(PDK1)轉(zhuǎn)錄，促進細胞代謝方式從有氧氧化向糖酵解轉(zhuǎn)變，同時限制代謝產(chǎn)物乙酰輔酶A(acetyl-CoA)的轉(zhuǎn)化生成。乙酰輔酶A的降低使其作為底物參與三羧酸循環(huán)的過程也被抑制，導致腫瘤用于脂肪酸合成的主要底物從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝?/p>

4、酰胺?；蛐酒治鼋Y(jié)果顯示在放療耐受的宮頸癌細胞中谷氨酰胺酶2(GLS2)顯著高表達，提示我們對放射線治療產(chǎn)生耐受的腫瘤細胞可能存在適應(yīng)性的谷氨酰胺代謝活化，然而其潛在調(diào)控機制尚不清楚。
　　目的：
　　1.研究HIF-1α對乳腺癌干細胞表型的影響作用，進一步探討HIF-1與TAZ之間的相互調(diào)控機制以及HIF-1通過作用Hippo信號通路對TAZ核轉(zhuǎn)位的影響作用;
　　2.研究HIF-1α對調(diào)控宮頸癌細胞谷氨酰胺代謝重

5、編程誘導放療耐受的作用機制。
　　方法：
　　1.利用腫瘤基因TCGA數(shù)據(jù)庫分析WWTR1基因與HIF靶基因之間的表達相關(guān)性。對于細胞缺氧處理，采用缺氧小室培養(yǎng)細胞，室內(nèi)灌入1％氧氣、5％氮氣和94％二氧化碳。采用免疫組化染色、實時定量PCR和Western blot檢測乳腺癌組織及細胞中TAZ的表達情況。利用熒光素酶報告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測HIF-1對TAZ以及SIAH1基因啟動子活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。利用免疫共沉

6、淀技術(shù)檢測LATS2和SIAH1之間的蛋白結(jié)合作用。免疫熒光染色用于檢測TAZ的核定位。采用Aldefluor干細胞檢測試劑盒、流式細胞儀和乳腺干細胞成球?qū)嶒灆z測HIF-1和TAZ對乳腺癌干細胞表型維持的調(diào)控作用。為高效敲低TAZ，SIAH1和LATS2的蛋白表達水平，采用慢病毒pLKO.1嘌呤霉素質(zhì)粒編碼的RNA干擾載體，分別與pCMV-dR8.91同時轉(zhuǎn)染293T細胞，收集得到的慢病毒上清液再轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，并采用嘌呤霉素篩選得到有

7、效的干擾細胞系。運用Kaplan-Meier生存曲線及Wilcoxon秩和檢驗分析乳腺癌病人雙陽性HIF-TAZ靶基因?qū)Ρ入p陰性或單陽性HIF-TAZ靶基因的存活率差異。
　　2.研究HIF-1調(diào)控宮頸癌細胞谷氨酰胺代謝重編程以及其放療耐受產(chǎn)生的機制，首先采用2 Gy的放射線連續(xù)亞致死劑量照射宮頸癌Hela細胞株，重復照射25次，總劑量達50Gy，總時長為6個月左右。利用免疫組化染色和Western blot實驗檢測GLS2的蛋白

8、表達水平。建立GLS2慢病毒干擾載體，首先設(shè)計GLS2-shRNA干擾序列并插入慢病毒pGCL-GFP綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體，并且做后續(xù)的細胞轉(zhuǎn)染和篩選?？寺⌒纬蓪嶒灪土魇郊毎嫈?shù)分別用于檢測各處理組的放療敏感性變化以及細胞凋亡和細胞周期改變。免疫熒光染色二氫乙錠用于檢測細胞內(nèi)活性氧水平變化。比色酶標檢測試劑盒用于檢測樣本中還原型和氧化性谷胱甘肽的比率差異。NAD+/NADH比率檢測試劑盒和NADP+/NADPH定量比色分析試劑盒分別用于

9、檢測NADH和NADPH的水平變化情況。建立小鼠移植瘤模型，對比不同處理組細胞的增殖能力。最后，采用免疫組化染色及進行GLS2與宮頸癌病人臨床病理學特征的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：
　　1.HIF-1和TAZ之間的多重調(diào)控機制以及其對乳腺癌干細胞表型的調(diào)控作用
　　1.1 通過分析腫瘤病人基因數(shù)據(jù)庫得出基因表達熱圖顯示TAZ mRNA表達水平與隨機輸入的10個HIF靶基因呈顯著正相關(guān)。實時定量PCR和Westem blo

10、t結(jié)果提示TAZ的mRNA及蛋白表達水平在5種不同的乳腺癌細胞株經(jīng)過缺氧處理后呈顯著高表達，然而在HIF-1α敲低細胞株中，TAZ的高表達受到明顯抑制。利用UCSC基因數(shù)據(jù)庫分析TAZ編碼基因WWTR1基因序列中的潛在HIF結(jié)合位點最終得到在此基因反義鏈的第二個內(nèi)含子內(nèi)的一段序列5'-GCGTGGCACACA-3'，并且ChIP實驗證明這段序列為HIF-1α和HIF-1β的結(jié)合位點。最后，利用熒光素酶報告基因檢測這一結(jié)合位點是否具有功能

11、性，結(jié)果顯示，野生序列載體熒光素酶活性在缺氧條件下顯著升高，而突變序列載體則轉(zhuǎn)錄收到抑制。
　　1.2 敲低TAZ未影響HIF-1α或者HIF-2α的蛋白表達。通過ChIP實驗證明，敲低HIF-1α或者HIF-1β可影響TAZ與其下游靶基因CTGF的結(jié)合水平。TAZ靶基因CTGF、PAI-1和Survivin的mRNA和蛋白水平在乳腺癌細胞株缺氧條件下也受HIF-1α的調(diào)控。次外，免疫熒光染色和Western blot結(jié)果顯示TA

12、Z在常氧條件下主要表達在細胞質(zhì)中;而缺氧條件下TAZ大量定位在細胞核中表達，胞質(zhì)中其分布則相應(yīng)有所下降。
　　1.3 為進一步探討缺氧對于Hippo信號通路的影響，采用Western blot檢測其通路級聯(lián)反應(yīng)中LATS家族的表達變化，發(fā)現(xiàn)只有LATS2的蛋白水平受到抑制，并且這一過程為HIF依賴的調(diào)控方式。分析與缺氧相關(guān)的E3泛素蛋白連接酶發(fā)現(xiàn)其中SIAH1受HIF-1調(diào)控，且LATS2在缺氧環(huán)境下的降解是通過泛素蛋白酶體降解途

13、徑。進一步采用ChIP實驗檢測出HIF-1與SIAH1的HRE結(jié)合位點。
　　1.4 采用Aldefluor干細胞檢測試劑盒、流式細胞儀和乳腺干細胞成球?qū)嶒灆z測缺氧對乳腺癌干細胞干性維持的調(diào)控作用，結(jié)果提示ALDH陽性的干細胞百分比在缺氧條件下顯著升高，干擾HIF-1α或TAZ降低乳腺癌干細胞數(shù)量及成球能力。另外，敲低SIAH1或LATS2也能影響乳腺癌干細胞表型及TAZ細胞核轉(zhuǎn)位。進一步在動物試驗中驗證這一結(jié)果顯示HIF-1α敲

14、低細胞的成瘤能力顯著受到抑制。最后，Kaplan-Meier生存分析表明雙陽性表達HIF和TAZ靶基因特征的乳腺癌病人的生存率顯著降低。
　　2.HIF-1對宮頸癌谷氨酰胺代謝重編程及其所致的腫瘤放療耐受的調(diào)控作用
　　2.1 建立宮頸癌HelaR放療耐受細胞株，其次采用克隆形成實驗及流式細胞儀測細胞凋亡和細胞周期實驗來驗證此細胞株放療耐受特性的確立。進一步通過基因芯片分析放療耐受細胞株與敏感細胞株的基因表達譜差異，發(fā)現(xiàn)谷氨

15、酰胺代謝通路及其關(guān)鍵酶GLS2的活化在宮頸癌放療耐受細胞株中明顯上調(diào)。緊接著干擾GLS2發(fā)現(xiàn)，放療耐受組細胞的克隆形成能力顯著降低，放療敏感性增加。此外，對比放療耐受組細胞與對照組細胞在接受6 Gy劑量放射線照射后48小時的細胞凋亡數(shù)量發(fā)現(xiàn)，GLS2干擾組檢測到更多的細胞凋亡量。
　　2.2 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)敲低GLS2顯著增加放射線照射后細胞內(nèi)ROS的生成。進一步檢測還原型和氧化型谷胱甘肽的比率發(fā)現(xiàn)，GSH/GSSG比率在放療

16、耐受HelaR細胞株中顯著呈高比率狀態(tài)，而GLS2敲低細胞中此比率明顯下降。與GSH相似，檢測抗氧化劑NADH以及NADPH在不同細胞組中的水平變化，發(fā)現(xiàn)還原型NADH和NADPH也在放療耐受細胞株中呈較高水平狀態(tài)，而在GLS2敲低細胞中其生成明顯下降。
　　2.3 建立小鼠移植瘤模型用體內(nèi)實驗進一步驗證GLS2對宮頸癌放療耐受的調(diào)控作用。結(jié)果證明放療耐受的宮頸癌細胞移植瘤組小鼠腫瘤增殖明顯高于野生宮頸癌細胞移植瘤組，然而GLS2

17、敲低后，小鼠移植瘤增殖得到抑制。另外，免疫組化染色臨床宮頸癌病人標本顯示GLS2在對放射線治療耐受的病人標本中表達明顯高于放療敏感的病人腫瘤組織。統(tǒng)計學分析進一步提示GLS2的表達與宮頸癌放療敏感性高度相關(guān)。最后，基因表達相關(guān)性分析表明GLS2 mRNA與HIF靶基因表達呈顯著正相關(guān)性。實時定量PCR和Western blot實驗結(jié)果證明HIF-1α干擾細胞中GLS2表達明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.TAZ是HIF-1的靶