HIF-1α通過(guò)N1ICD誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性.pdf

1、腫瘤內(nèi)一小部分細(xì)胞具有自我更新、多潛能分化等干細(xì)胞特性，能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞并啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生，這一部分細(xì)胞被稱(chēng)為腫瘤干細(xì)胞(CSCs)。CSCs的起源及維持因素不是很清楚。有研究表明，缺氧和HIFs可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得CSCs特性，但分子機(jī)制不明。Notch信號(hào)通路為細(xì)胞間信息傳遞的重要方式之一。有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)通路在肺CSCs特性的誘導(dǎo)或維持中發(fā)揮重要作用，但Notch的哪些成分在其中發(fā)揮作用目前還不清楚。本研究假設(shè)缺氧通過(guò)H

2、IF-1α增強(qiáng)Notch1信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得CSCs特性。采用慢病毒載體及轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。qPCR探討缺氧對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響以及 Notch1信號(hào)通路在其中的作用。qPCR進(jìn)一步探討 HIF-1α和 N1ICD對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。運(yùn)用構(gòu)建好的HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株，通過(guò)藥物敏感實(shí)驗(yàn)、成球?qū)嶒?yàn)以及體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)探討HIF-1α/N1

3、ICD對(duì)肺腺癌細(xì)胞CSCs特性的影響，試圖為理解NSCLC的生物學(xué)行為提供理論依據(jù)。
　　第2章 HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建
　　目的：利用慢病毒載體構(gòu)建HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。
　　方法：以人 HIF-1α基因編碼序列為模板，設(shè)計(jì)并合成引物。PCR法擴(kuò)增HIF-1α基因，用以構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro。PCR和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提慢病毒重組質(zhì)粒和

4、輔助質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒(LV-HIF-1α)。同時(shí)構(gòu)建慢病毒空載載體(LV-RFP-Puro)作為對(duì)照。采用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。制備好的LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀(guān)察篩選效果，Western blotting進(jìn)一步驗(yàn)證。MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡。
　　結(jié)果：重組慢病毒質(zhì)粒HBLV-HIF-1α-RFP-Puro經(jīng)PCR、基因測(cè)

5、序鑒定構(gòu)建成功。經(jīng)包裝、濃縮后獲得高滴度 LV-HIF-1α和 LV-RFP-Puro。LV-HIF-1α和LV-RFP-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后經(jīng)藥物反復(fù)篩選，熒光顯微鏡下觀(guān)察到70-80％的細(xì)胞帶有紅色熒光。Western blotting結(jié)果顯示A549-HIF-1α組HIF-1α、N1ICD、Hes1和Hey1蛋白的表達(dá)水平明顯高于A(yíng)549-RFP-Puro組。HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　

6、　結(jié)論：HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)肺腺細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　第3章 N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建
　　目的：利用慢病毒載體構(gòu)建N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株。
　　方法：以人N1ICD基因編碼序列為模板，設(shè)計(jì)并合成引物。PCR擴(kuò)增N1ICD基因，用以構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro。PCR和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共

7、轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒(LV-N1ICD)。同時(shí)構(gòu)建慢病毒空載載體(LV-ZsGreen-Puro)。采用稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定病毒滴度。制備好的LV-N1ICD和LV-ZsGreen-Puro轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率，Western blotting檢測(cè)N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表達(dá)。MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡。
　　結(jié)果：PCR及基因測(cè)序結(jié)果表明重組慢病毒

8、質(zhì)粒 pHBLV-N1ICD-ZsGreen-Puro構(gòu)建成功。經(jīng)包裝、濃縮后獲得高滴度LV-N1ICD和LV-ZsGreen-Puro。慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后經(jīng)藥物反復(fù)篩選，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)70～80%的細(xì)胞帶有綠色熒光。Western blotting結(jié)果顯示A549-N1ICD組N1ICD、Hes1、Hey1和HIF-1α的表達(dá)水平明顯高于A(yíng)549-ZsGreen-Puro組。N1ICD穩(wěn)定表達(dá)可促進(jìn)A549細(xì)胞增殖。

9、　　結(jié)論：N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。N1ICD穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)肺腺細(xì)胞增殖。
　　第4章 HIF-1α通過(guò)N1ICD誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性
　　目的：探討HIF-1α和N1ICD在缺氧誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性中的作用。
　　方法：qPCR探討缺氧對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1、 KLF4和Sox2表達(dá)的影響以及Notch1信號(hào)通路在其中的作用。利

10、用構(gòu)建好的HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)肺腺癌細(xì)胞株，qPCR探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。CCK-8探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞順鉑和多西他賽敏感性的影響，計(jì)算IC50。成球?qū)嶒?yàn)探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞自我更新能力的影響。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)探討HIF-1α和Notch1信號(hào)通路對(duì)肺腺癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　結(jié)果：缺氧可誘導(dǎo)A549細(xì)胞

11、CD133、Oct4、c-Myc、ABCG2、ALDH1和Sox2等干細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)，抑制Notch1信號(hào)通路后，干細(xì)胞標(biāo)志物水平明顯下降。HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞多重干細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)，抑制 Notch1信號(hào)通路可明顯抑制 HIF-1α誘導(dǎo)的干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。HIF-1α和N1ICD穩(wěn)定表達(dá)均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞對(duì)順鉑和多西他賽耐藥，抑制Notch1信號(hào)通路后，A549-HIF-1α細(xì)胞恢復(fù)了對(duì)順鉑和多西