缺氧通過HIF-1α誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌TNF-α的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分，目的：越來越多證據(jù)顯示急性心肌梗死中過量腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞不利。心肌缺血時(shí)，TNF-α主要來源于巨噬細(xì)胞。隨著缺血狀態(tài)的持續(xù)，心肌細(xì)胞開始分泌TNF-α。我們探討缺氧是否通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子TNF-α。
　　 方法：和結(jié)果：分離新生大鼠乳鼠心肌細(xì)胞，

2、分別給予氧濃度1％缺氧刺激5分鐘，15分鐘，30分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)。Westernblot 檢測細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平；免疫熒光檢測HIF-1α蛋白表達(dá)以及入核情況；實(shí)時(shí)定量RT-PCR 檢測TNF-αmRNA表達(dá)水平；ELISA 檢測TNF-α蛋白表達(dá)分泌。結(jié)果顯示TNF-αmRNA 從1小時(shí)開始表達(dá)上調(diào)，與空白組相比增加至1.99±0.27倍（p<0.01），12小時(shí)及24小時(shí)達(dá)峰值，分別

3、為4.06±0.84倍和4.09±0.81倍（p<0.01）。TNF-α蛋白分泌表達(dá)在6小時(shí)可檢測到，12小時(shí)達(dá)峰值為48.12±11.52pg/ml（p<0.01）。缺氧對(duì)HIF-1αmRNA水平無影響，HIF-1α蛋白缺氧30分鐘表達(dá)明顯，1小時(shí)達(dá)峰值。免疫熒光染色提示缺氧15分鐘HIF-1α蛋白開始表達(dá)且向核內(nèi)聚積。核轉(zhuǎn)染法進(jìn)行心肌細(xì)胞HIF-1αRNA 干擾，發(fā)現(xiàn)siRNA顯著抑制HIF-1αmRNA水平的同時(shí)，抑制缺氧12小時(shí)

4、后TNF-αmRNA水平上調(diào)（3.75±0.45 foldvs1.38±0.76 fold, p<0.01）。HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）能有效抑制缺氧刺激后HIF-1α蛋白表達(dá)，也能抑制缺氧12小時(shí)后TNF-αmRNA水平上調(diào)（2.82±0.41foldvs1.31±0.37 fold,p<0.01）以及蛋白分泌（48.12±11.52pg/mlvs23.22±2.62, p<0.

5、05）。
　　 結(jié)論：缺氧能誘導(dǎo)離體心肌細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α，HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自分泌TNF-α過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　 第二部分，目的：探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）對(duì)于腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是否有直接啟動(dòng)作用。
　　 方法：和結(jié)果：培養(yǎng)HEK293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞

6、，給予氧濃度1％缺氧刺激及氯化鈷模擬缺氧刺激后，western blot 檢測胞核HIF-1α蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量RT-PCR 檢測TNF-αmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示缺氧6小時(shí)及氯化鈷刺激3小時(shí)可明顯觀察到HIF-1α蛋白在胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，缺氧12h及氯化鈷刺激12h后與空白組相比TNF-αmRNA水平明顯上升。HIF-1α抑制劑2-甲氧雌二醇（2-methoxyestradiol，2ME2）能有效抑制氯化鈷模擬缺氧刺激后HIF-1

7、α在核內(nèi)聚積，也能抑制氯化鈷模擬缺氧刺激后TNF-αmRNA水平上調(diào)。分析TNF-α轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5000bp的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)七個(gè)可能缺氧反應(yīng)元件（hypoxiaresponse elements，HREs）。5’端續(xù)減法構(gòu)建8個(gè)不同長度的報(bào)告基因質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞和HepG2細(xì)胞，予氧濃度1％缺氧刺激24小時(shí)后雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示TNF-α轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1470bp 處可能為缺氧誘導(dǎo)TNF