鈣拮抗劑通過TNF-α-NF-κB環(huán)路介導的非鈣通道阻斷作用抗心肌細胞缺氧復氧損傷的研究.pdf

1、鈣拮抗劑（Calcium antagonists）是一類選擇性阻止電壓依賴性鈣通道，抑制細胞外Ca2+內流，降低細胞內Ca2+濃度的藥物。按照化學結構，鈣拮抗劑主要分為3類：二氫吡啶類，硫氮雜卓類，苯烷胺類。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F(xiàn)2）是我課題組研究合成的一個新化合物。前期研究表明，F(xiàn)2有拮抗鈣超載保護心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷或心肌

2、細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）損傷的作用。F2能夠激活非鈣依賴型PKCε轉位，保護心肌細胞H/R損傷；此外，在 L-型鈣通道缺失的心臟微血管內皮細胞上，F(xiàn)2對H/R損傷依然有保護作用。文獻報道，地爾硫卓、氨氯地平和維拉帕米可通過不依賴于改變細胞內鈣濃度的途徑影響轉錄因子N F-IL6和N F-κB的活性。上述研究結果提示，鈣拮抗劑對心肌細胞H/R損傷具有非鈣依賴的保護機制。腫瘤壞死因子（tumor

3、necrosis factor alpha, TNF-α）作為一種多功能的細胞因子，在炎癥反應、免疫應答等多種生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用。有文獻報道，心肌I/R及心肌細胞H/R刺激下，TNF-α激活且表達上調是導致心肌功能紊亂的一重要因素。結合前期的基因芯片數(shù)據，在無鈣液H/R模型中，TNF-α表達上調，F(xiàn)2處理后TNF-α表達下調。提示我們，TNF-α可能參與無鈣液 H/R引起的心肌損傷。因此，本研究首先通過觀察無鈣液條件下H/R

4、心肌細胞中TNF-α的變化，及鈣拮抗劑對TNF-α表達的影響；進一步探討無鈣液H/R時，H9C2心肌細胞是否介導 TNF-α/NF-κB環(huán)路以及鈣拮抗劑是否可以通過調節(jié)此環(huán)路保護心肌細胞H/R損傷。
　　方法：
　　第一部分鈣拮抗劑對無鈣液H/R心肌細胞中TNF-α表達的影響
　　1.將培養(yǎng)的H9C2心肌細胞隨機分組：①對照(Ca2+1h)組；②無鈣液(0 Ca2+)組；③無鈣液缺氧復氧（0 Ca2+H/R）組；④無鈣

5、液+不同鈣拮抗劑組；⑤無鈣液+DMSO組；⑥無鈣液H/R+DMSO組；⑦無鈣液H/R+不同劑量鈣拮抗劑組。
　　2. Real-Time PCR方法檢測H9C2心肌細胞中TNF-αmRNA水平。
　　3. ELISA方法檢測H9C2心肌細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10濃度。
　　4.線粒體膜電位（JC-1）方法檢測H9C2心肌細胞早期凋亡。
　　5.比色法檢測H9C2心肌細胞中乳酸脫氫酶（LDH

6、）含量。
　　第二部分鈣拮抗劑對無鈣液H/R心肌細胞中TNF-α/NF-κB環(huán)路的影響
　　1.將培養(yǎng)的H9C2心肌細胞隨機分組：對照（Ca2+1h）組、無鈣液1h(0 Ca2+1h)組、無鈣液H/R組、無鈣液H/R+DMSO組、無鈣液H/R+F2組、無鈣液H/R+Ver組、無鈣液H/R+Dil組、無鈣液H/R+Nif組、無鈣液H/R+F2+TNF-α組、無鈣液H/R+Ver+TNF-α組、無鈣液H/R+TNF-α組、無鈣液

7、H/R+anti-TNF-αmab組、無鈣液1.0h+TNF-α組、無鈣液H/R+PDTC組、無鈣液H/R+LPS組,、control+P65組、control+vecter組。
　　2.ELISA方法檢測H9C2心肌細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α，IL-6，IL-10濃度。
　　3.Western-blot法檢測無鈣液H/R H9C2心肌細胞p-P65，P65，p-IKB-α，IKB-α，p-IKKα/β， IK Kα/β蛋

8、白表達的變化。
　　4.線粒體膜電位（JC-1）方法檢測H9C2心肌細胞早期凋亡。
　　5.比色法檢測H9C2心肌細胞中LDH含量。
　　6.雙熒光素酶報告基因(Dual-Luciferase)檢測 H9C2心肌細胞 NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase熒光比值。
　　7.免疫熒光檢測H9C2心肌細胞NF-κB的核轉位。
　　結果：
　　第一部分鈣拮抗劑對

9、無鈣液H/R心肌細胞中TNF-α表達的影響
　　1.無鈣液培養(yǎng)可刺激H9C2心肌細胞生成 TNF-α，無鈣液培養(yǎng)1h后隨著培養(yǎng)時間的延長釋放生成的TNF-α含量逐步升高，鈣拮抗劑對無鈣液培養(yǎng)所致TNF-α升高無影響。無鈣液中加入H0.5h/R0.5h刺激，可明顯激活H9C2心肌細胞釋放TNF-α，隨著無鈣液H/R時間的延長，培養(yǎng)液中TNF-α含量逐步升高。同時，無鈣液H/R可促進H9C2心肌細胞釋放IL-6，LDH及減少IL-10

10、的生成。不同濃度的F2及Ver可劑量依賴地下調無鈣液H/R所致心肌細胞TNF-α，IL-6，LDH含量的升高及IL-10的降低，而Dil，N if對TNF-α表達上調無影響。
　　2.F2及Ver能劑量依賴地抑制無鈣液H/R所致H9C2心肌細胞中TNF-α mRNA的表達，而Dil，Nif對TNF-α的mRNA表達無影響。
　　3.F2及Ver能劑量依賴地抑制無鈣液H/R所致H9C2心肌細胞早期凋亡。
　　第二部分鈣拮

11、抗劑對無鈣液H/R心肌細胞中TNF-α/NF-κB環(huán)路的影響
　　1.無鈣液H/R可激活H9C2心肌細胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白表達，F(xiàn)2及Ver能下調其表達。而Dil，Nif對其表達無影響。
　　2. TNF-α單克隆抗體可下調無鈣液H/R所致p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β的高表達，抑制細胞LDH的漏出，減少早期細胞凋亡，降低炎癥因子IL-6，IL-10的釋放。重組大鼠TNF-α可拮抗

12、F2及Ver對無鈣液H/R心肌細胞p-P65，p-IKB-α，p-IKKα/β蛋白高表達的抑制作用，拮抗F2及ver的心肌保護作用。
　　3. NF-κB抑制劑PDTC可下調無鈣液H/R所致的TNF-α蛋白高表達。
　　4.無鈣液H/R可致NF-κB的信號轉錄活性上調，促使NF-κB Luciferase，TNF-αpromoter Luciferase熒光比值升高。F2及Ver對其具有抑制作用，加入外源TNF-α，LPS刺

13、激或轉染P65質粒，可對抗F2及Ver的作用。
　　5.無鈣液H/R可致NF-κB從細胞質向細胞核轉移，F(xiàn)2及Ver對其具有抑制作用。
　　結論：
　　1.無鈣液刺激可誘發(fā)H9C2細胞生成TNF-α。無鈣液條件下加入H/R可刺激TNF-α高表達，F(xiàn)2及Ver可抑制無鈣液H/R所致TNF-α高表達。
　　2.F2及Ver可通過TNF-α/NF-κB環(huán)路抑制TNF-α的表達可能是其抗H9C2心肌細胞無鈣液H/R損傷的