乳腺癌缺氧微環(huán)境中HIF-2α誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞形成的研究.pdf

1、引言：
　　腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cells，TSCs)能夠進(jìn)行自我更新、無限制地生長并能產(chǎn)生異質(zhì)性的癌細(xì)胞。缺氧微環(huán)境作為腫瘤干細(xì)胞壁龕的重要組成部分，和實(shí)體腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，并影響腫瘤中腫瘤干細(xì)胞的演進(jìn)和抗凋亡能力[1,2]。缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)家族[3-7]包括HIF-1α和HIF-2α，在這些反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。近期研究表明，HIF-2α具有雙重性，可

2、能是致癌基因，也可能是抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，而且 HIF-2α基因在腫瘤干細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α基因在多種人惡性腫瘤組織中（包括乳腺癌）均呈現(xiàn)高表達(dá)[8]，可能涉及包括血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞維持、抗凋亡、促進(jìn)耐藥基因的表達(dá)等多個(gè)方面，從而加速腫瘤惡性轉(zhuǎn)變。
　　本研究擬采用生物信息學(xué)工具分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中1173例乳腺癌測序數(shù)據(jù)，挖掘與缺氧相關(guān)的差異表達(dá)基因，尋找與HIF-2

3、α有差異表達(dá)關(guān)系的基因。通過Knock up/down技術(shù)分析相互之間的調(diào)控關(guān)系，明確HIF-2α在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的生物學(xué)功能，探索其促進(jìn)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞發(fā)生的機(jī)制。
　　第一部分 TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘HIF-2α及其表達(dá)相關(guān)基因在乳腺癌中表達(dá)及驗(yàn)證
　　目的:
　　檢測HIF-2α與其表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌及癌組織中的表達(dá)水平。
　　方法:
　　利用生物信息學(xué)工具挖掘T

4、CGA數(shù)據(jù)庫，分析1173例浸潤性乳腺癌標(biāo)本的測序結(jié)果中尋找HIF-2α的表達(dá)相關(guān)基因及其相關(guān)通路，分析各個(gè)通路中可能與缺氧及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)的基因；利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析HIF-2α在1173乳腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其表達(dá)程度與病人預(yù)后的相關(guān)性；采用IHC方法檢測45例女性乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的表達(dá)，并分析其與乳腺癌患者臨床病理的關(guān)系；采用Real-time PCR法檢測45例樣本中HIF-2α及其表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、S

5、MAD2、OCT4 mRNA表達(dá)情況及與乳腺癌患者臨床病理間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　從TCGA數(shù)據(jù)庫中1173例乳腺癌標(biāo)本測序數(shù)據(jù)中分析獲得165個(gè)基因表達(dá)與HIF-2α呈正相關(guān)，46個(gè)基因與HIF-2α呈負(fù)相關(guān)；與缺氧及腫瘤干細(xì)胞形成相關(guān)的基因主要聚集在3條路徑上：HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-βsignaling pathway；TCGA預(yù)后數(shù)據(jù)分

6、析顯示，HIF-2α高表達(dá)對乳腺癌患者來說意味著更差的預(yù)后；
　　免疫組化結(jié)果顯示HIF-2α蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織中的表達(dá)，并且HIF-2α蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在顯著相關(guān)性 p<0.05；熒光定量 PCR檢測 HIF-2α及其表達(dá)相關(guān)基因 TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌組織中的基因表達(dá)水平分別為3.7211±1.4000、6.0131±1.1832、4.5751±1.118

7、4顯著高于癌旁組織P<0.05，與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致。
　　小結(jié):
　　通過TCGA數(shù)據(jù)庫信息分析結(jié)合免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-2α高表達(dá)是乳腺癌不良預(yù)后的標(biāo)志；TGF-β、SMAD2、OCT4是缺氧條件下HIF-2α表達(dá)相關(guān)基因。
　　第二部分 HIF-2α在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中生物學(xué)功能的研究
　　目的:
　　應(yīng)用慢病毒感染方法獲得MCF-7 HIF-2α knock up/down的穩(wěn)定細(xì)胞株

8、，進(jìn)一步研究HIF-2α對乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、克隆形成能力和遷移能力等分子機(jī)制的影響；
　　方法:
　　利用HIF-2α ORF和HIF-2α shRNA慢病毒分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，篩選構(gòu)建MCF-7 HIF-2α knock up/down的穩(wěn)定細(xì)胞株；在MCF-7 HIF-2α knock down細(xì)胞株上聯(lián)合CoCl2誘導(dǎo)環(huán)境缺氧，利用Realtime-PCR和Western Blot方法分

9、別檢測HIF-2α及其表達(dá)相關(guān)基因（TGF-β、SMAD2和OCT4）mRNA和蛋白的表達(dá)水平；利用EdU檢測HIF-2α對細(xì)胞增殖的影響；利用CCK-8方法檢測細(xì)胞活力；細(xì)胞遷移能力的變化采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測；細(xì)胞侵襲能力變化采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測；細(xì)胞的成瘤能力使用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測。
　　結(jié)果:
　　慢病毒感染后，通過篩選獲得穩(wěn)定的MCF-7 HIF-2α Knock up/down細(xì)胞株；Real-time

10、 PCR和Western blot結(jié)果顯示在CoCl2誘導(dǎo)的缺氧條件下，HIF-2α及其表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達(dá)上調(diào)；在MCF-7 HIF-2α knock down細(xì)胞株中加入CoCl2，誘導(dǎo)形成缺氧環(huán)境，因RNAi的而存在無法上調(diào)HIF-2α的表達(dá)，而HIF-2α表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達(dá)受到抑制；EdU檢測結(jié)果顯示在MCF-7細(xì)胞中上調(diào) HIF-2α后，MCF-7細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，即

11、HIF-2α的高表達(dá)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖；CCK-8檢測證實(shí)HIF-2α高表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明HIF-2α高表達(dá)促進(jìn)MCF-7腫瘤細(xì)胞遷移；Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示HIF-2α高表達(dá)促進(jìn)MCF-7腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明HIF-2α高表達(dá)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞成瘤。
　　小結(jié):
　　HIF-2α與TGF-β、SMAD2和OCT4表達(dá)具有相關(guān)性，且HIF-2α能

12、夠增加細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲遷移；
　　第三部分 HIF-2α對乳腺癌腫瘤干細(xì)胞形成的影響
　　目的：
　　探討HIF-2α表達(dá)對低氧下乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特性（Breast Cancer Stem Cells，BCSCs）的影響。
　　方法：
　　采用免疫磁珠法得到人乳腺癌 MCF-7干細(xì)胞株，感染慢病毒獲得 MCF-7 CSCs HIF-2α knock up/down細(xì)胞株；Realtime-PCR

13、和Western blot檢測HIF-2α、TGF-β、SMAD2、OCT4 mRNA及蛋白在MCF-7 CSCs、MCF-7 CSCsHIF-2α knock up/down細(xì)胞株中表達(dá)的變化；CCK-8檢測試劑盒檢測HIF-2α對MCF-7 CSC細(xì)胞增殖活力的影響；
　　CoCl2聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)MCF-7 knock up/down細(xì)胞株，誘導(dǎo)獲得“乳腺癌腫瘤干細(xì)胞（Breast Cancer Stem Cells

14、，BCSCs）微球體”；流式細(xì)胞儀被用來檢測細(xì)胞的凋亡及乳腺癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物 CD44+的表達(dá)；裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)比較MCF-7 Knock up/down腫瘤干細(xì)胞的腫瘤生長速度，及成瘤能力。
　　結(jié)果：
　　采用表面抗體標(biāo)記磁納米顆粒法分選獲得的乳腺癌MCF-7干細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染后篩選獲得MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down細(xì)胞株；Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示在MCF-

15、7 CSC HIF-2α knock up細(xì)胞株中，HIF-2α及表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達(dá)上調(diào)；在MCF-7 HIF-2α knock down細(xì)胞株中因RNAi存在而抑制HIF-2α的表達(dá)，HIF-2α表達(dá)相關(guān)基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down經(jīng)CoCl2聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)的微球體中乳腺癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志

16、物CD44+細(xì)胞比例顯示，MCF-7 HIF-2α knock up細(xì)胞株形成微球體中CD44+細(xì)胞比例（91.07％）顯著高于MCF-7（79.21%）和MCF-7 HIF-2α knock down細(xì)胞株（51.6%）；CCK-8檢測結(jié)果顯示：HIF-2α過表達(dá)促進(jìn)MCF-7 CSC增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：HIF-2α過表達(dá)抑制MCF-7干細(xì)胞的凋亡；HIF-2α過表達(dá)的MCF-7干細(xì)胞成瘤能力明顯高于正常MCF-7干細(xì)胞和H

17、IF-2α下調(diào)的MCF-7干細(xì)胞。
　　小結(jié)：
　　缺氧環(huán)境下上調(diào)HIF-2α能夠促進(jìn)MCF-7腫瘤干細(xì)胞的形成，并有促增殖作用和抑制MCF-7腫瘤干細(xì)胞凋亡，上調(diào)MCF-7腫瘤干細(xì)胞TGF-β、SMAD2和OCT4蛋白和mRNA的表達(dá)。裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-2α過表達(dá)明顯增加MCF-7腫瘤干細(xì)胞的成瘤能力。
　　結(jié)論
　　1．乳腺癌組織中HIF-2α過表達(dá)，可能與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)；
　　2、在缺氧微環(huán)境

18、中TGF-β、SMAD2、OCT4是HIF-2α的表達(dá)相關(guān)基因；
　　3、在乳腺癌MCF-7細(xì)胞及MCF-7干細(xì)胞中過表達(dá)HIF-2α能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和成瘤能力；
　　4、缺氧條件下，上調(diào)MCF-7細(xì)胞中HIF-2α的表達(dá)，能夠促進(jìn)MCF-7 CSCs的發(fā)生；
　　5、HIF-2α過表達(dá)的MCF-7 CSCs成瘤能力明顯高于正常MCF-7 CSCs和HIF-2α下調(diào)的MCF-7