α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)誘發(fā)高致瘤性干細胞樣乳腺癌細胞機制研究.pdf

1、目的：研究α-KG類似物α-酮戊二酸二甲酯(DM-2KG)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）誘發(fā)高致瘤性干細胞樣乳腺癌細胞的發(fā)生機制。
　　方法：通過體外常氧或缺氧條件下的細胞培養(yǎng)，應(yīng)用細胞集落形成試驗、臺盼藍拒染試驗、三磷酸腺苷(ATP)定量試驗、乳腺細胞球形成試驗、報告基因質(zhì)粒構(gòu)建及雙螢光素酶報告基因檢測法、Western分析、小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）、半定量巢式RT-PCR、

2、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色、免疫熒光染色和成像及流式細胞術(shù)、以及體外動物實驗進行腫瘤異體移植等技術(shù)手段，研究DM-2KG對乳腺癌細胞的作用。
　　結(jié)果：⑴α-KG作為PHDs的輔助因子，可激活PHDs，促進HIF-1α的降解，但是具有跨膜滲透能力的DM-2KG區(qū)別于另一種α-KG類似物octyl-2KG，其在常氧條件下，不僅沒有促進HIF-1α的降解，反而特異性提高HIF-1α蛋白水平，并能進一步激發(fā)HIF-1

3、α下游目標(biāo)基因，如GLUT1、VEGF和PDK1等的表達。⑵DM-2KG是通過抑制HIF-1α蛋白的降解環(huán)節(jié)而上調(diào)其表達水平。⑶DM-2KG促進HIF-1α蓄積是通過抑制PHD2介導(dǎo)的HIF-1αPro564羥基化實現(xiàn)的。⑷DM-2KG可以通過誘導(dǎo)p21基因表達，抑制乳腺癌細胞增殖并誘發(fā)產(chǎn)生具可逆性生長的靜止期癌細胞。⑸經(jīng)過較長周期DM-2KG培養(yǎng)后，DM-2KG還可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞高表達腫瘤干細胞標(biāo)志物CD44，從而使這類癌細胞具備干

4、細胞的表型。⑹經(jīng)DM-2KG預(yù)處理后的MDA-MB-231細胞的體外和體內(nèi)的成瘤能力均明顯增強，這組細胞符合腫瘤干細胞的生物學(xué)特性。⑺當(dāng)用shRNA敲減乳腺癌細胞HIF-1α表達后，p21和CD44表達、DM-2KG誘發(fā)的高致瘤性均將受抑制，提示DM-2KG誘發(fā)乳腺癌細胞的靜止期和干細胞樣表型具有HIF-1α依賴性的特點。
　　結(jié)論：DM-2KG可以通過抑制PHD2功能，上調(diào)HIF-1α蛋白水平，從而抑制乳腺癌細胞增殖，并誘發(fā)產(chǎn)生