馬鈴薯StCOL和StTFL1的克隆及其在塊莖形成中的功能分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是僅次于水稻、小麥、玉米之后的第四大糧食作物。塊莖是馬鈴薯的繁殖器官，也是產(chǎn)品器官。研究馬鈴薯塊莖形成的調(diào)控機(jī)制，不僅具有理論價(jià)值，而且對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量提高具有指導(dǎo)意義.馬鈴薯塊莖形成是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，并受內(nèi)在因素及外界因素的調(diào)控。最近，有報(bào)道將擬南芥的AtCO基因?qū)腭R鈴薯，在短日照條件下，AtCO過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致塊莖形成減少，說(shuō)明AtCO對(duì)塊莖的形成有負(fù)調(diào)節(jié)作用。但是其調(diào)控塊莖形成

2、機(jī)制以及內(nèi)源CO在塊莖形成中作用仍不清楚。為了揭示CO在馬鈴薯塊莖形成中的作用，本文克隆了馬鈴薯StCOL、StTFL1和StLFY基因，并通過(guò)構(gòu)建StCOL反義抑制和StTFL1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，初步分析了StCOL和StTFL1對(duì)塊莖形成的作用。主要研究結(jié)果如下： 1.克隆了一個(gè)馬鈴薯StCOL cDNA序列(DQ882684)、基因組DNA序列及其啟動(dòng)子。該基因由一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子構(gòu)成，StCOL cDNA序列含有一個(gè)

3、1083 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)360個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，StCOL分子量為39.21 kD，等電點(diǎn)為5.09。采用DNAMAN對(duì)StCOL和其他同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明StCOL氨基酸序列與擬南芥的AtCO、AtCOL1、AtCOL2和AtCOL3的氨基酸序列具有較高的一致性，在N-和C-末端分別具有保守的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域，在蛋白C-末端有一保守的7肽序列(YGVVPSF)；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明StCO

4、L與豌豆PsCOLb及擬南芥AtCOL3分子的親緣關(guān)系最近；StCOL基因啟動(dòng)子序列上游有8個(gè)TATA-box、4個(gè)CAAT-box、1個(gè)I-box、4個(gè)GATA-box等多個(gè)順式作用元件。采用半定量RT-PCR方法對(duì)StCOL mRNA水平分析結(jié)果顯示，StCOL在馬鈴薯的根、莖、葉，頂芽、花芽和花中都有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)水平最高；對(duì)塊莖形成過(guò)程中該基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，在塊莖形成不同時(shí)期都有StCOL表達(dá)，在塊莖形成后期表達(dá)

5、水平較弱，在成熟塊莖中檢測(cè)不到該基因的表達(dá)。另外，體外微型薯的暗誘導(dǎo)過(guò)程中該基因持續(xù)表達(dá)，但該基因的表達(dá)水平不受蔗糖和赤霉素的影響。 2.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了馬鈴薯StTFL1 cDNA序列(DQ307621)。StTFL1 cDNA序列含有一個(gè)528 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由175個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白分子量為19.86 kD，等電點(diǎn)為8.73，66-88位氨基酸間具有PEBP蛋白典型的特征結(jié)構(gòu)，

6、采用DNAMAN軟件對(duì)StTFL1和其他同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明StTFL1和擬南芥TFL1、水稻CEN及煙草CEN在氨基酸水平有較高的一致性，而且擬南芥的TFL1和馬鈴薯的TFL1的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一樣。采用半定量RT-PCR方法對(duì)不同組織中該基因的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，StTFL1基因在馬鈴薯的根、莖、葉、頂芽和花芽中均表達(dá)，其中在根中的表達(dá)水平最高；另外，發(fā)現(xiàn)在塊莖形成的不同時(shí)期StTFL1都表達(dá)，尤其在匍匐莖形成時(shí)有高水平

7、的表達(dá)。 3.采用RT-PCR和RACE的方法克隆了馬鈴薯StLFY cDNA序列(EF062357)及基因組DNA序列(EU371047)。該基因由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成，StLFY cDNA含有一個(gè)1257 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由418個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，該蛋白分子量為46.37 kD，等電點(diǎn)為6.18.采用DNAMAN軟件對(duì)StLFY和其他同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果表明StLFY和AtLFY、NtFL2及

8、SILFY在氨基酸水平有較高的一致性，而且在氨基末端都有一個(gè)保守的富含脯氨酸的區(qū)域，半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，StLFY僅在馬鈴薯頂芽和花芽有較弱的表達(dá)，而且在匍匐莖初始形成時(shí)也有較弱表達(dá)。 4.為了進(jìn)一步了解StCOL和StTFL1與馬鈴薯塊莖形成的關(guān)系，首先優(yōu)化了一簡(jiǎn)便的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的馬鈴薯莖段遺傳轉(zhuǎn)化方法：莖段外植體暗中預(yù)培養(yǎng)2d，農(nóng)桿菌侵染5-8 min，暗中共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)和芽分化的培養(yǎng)基(MS+0

9、.5 mg/LTDZ+0.3 mg/L GA3+50 mg/L Kan+200 mg/L Car+200 mg/L Cef)，光照培養(yǎng)4～5周即有不定芽的生成.采用PCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化率約為5％.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了StCO L和StTFL1基因的遺傳轉(zhuǎn)化，初步對(duì)StCOL和StTFL1在塊莖形成中的作用以及它們之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。短日照條件下，與未轉(zhuǎn)化對(duì)照組相比，表達(dá)StCOL反義片段的轉(zhuǎn)基因株系葉片中StCOL mRNA水