馬氏珠母貝金屬硫蛋白cDNA克隆及其在不同環(huán)境因子影響下的表達.pdf

1、金屬硫蛋白(MT)是生物體內集重金屬解毒、清除自由基、維持細胞內金屬離子穩(wěn)態(tài)平衡等功能于一身的小分子蛋白，廣泛分布于生物體內。本文主要進行馬氏珠母貝金屬硫蛋白基因的克隆，鎘離子和鋅離子的聯(lián)合效應對馬氏珠母貝金屬硫蛋白基因表達的影響，以及溫度和鹽度的聯(lián)合效應對馬氏珠母貝金屬硫蛋白基因表達的影響。旨在為海洋無脊椎動物動物金屬硫蛋白的分子進化及環(huán)境因子影響下馬氏珠母貝金屬硫蛋白基因表達的研究提供科學的依據(jù)，為研究馬氏珠母貝MT基因的表達、維持

2、馬氏珠母貝細胞內環(huán)境穩(wěn)定及提高馬氏珠母貝抵抗不良環(huán)境的能力提供理論依據(jù)。具體研究如下：
　　采用RACE技術克隆首次從馬氏珠母貝(Pinctada martensii)中克隆金屬硫蛋白基因的cDNA全長。獲得的cDNA序列全長為512 bp(GenBank登陸號：KC197172)，5'UTR為30bp，3'UTR為245 bp，開放閱讀框為237 bp，編碼78個氨基酸，分子量為7.67 kD，理論等電點為5.83，半胱氨酸含量

3、豐富，占編碼氨基酸的26.9％，具有無脊椎動物金屬硫蛋白的特征序列CKCXXXCXCX(C是半胱氨酸，K是賴氨酸，X指除半胱氨酸以外的其他氨基酸)。蛋白序列特征分析表明，該序列與其他貝類的金屬硫蛋白基因具有很高的相似性，具備金屬硫蛋白的典型特征，是金屬硫蛋白家族的成員。
　　采用中心復合設計(Central composite face-centered, CCF)和響應曲面法在實驗室條件下研究了 Cd2+與 Zn2+對馬氏珠母貝

4、鰓組織的MT基因(SMT)與消化腺組織 MT基因(XMT)表達的影響。Cd2+、Zn2+的濃度范圍均為0-2mg/L。試驗結果表明：1.在馬氏珠母貝鰓組織中，Cd2+與 Zn2+兩因子一次效應、互作效應、二次效應及二次效應互作對SMT表達影響都極顯著(P<0.01)；(Cd2+)2與Zn2+互作時對SMT表達的影響不顯著(P>0.05)；Cd2+與(Zn2+)2互作時對SMT表達的影響極顯著(P<0.01)。而在馬氏珠母貝消化腺組織中C

5、d2+對XMT表達影響不顯著(P>0.05)，Zn2+對XMT表達影響極顯著(P<0.01)。2.從響應曲面圖中可以看出，當不加入 Zn2+時，XMT表達量的相對值隨著加入Cd2+濃度的上升呈先升高后降低的趨勢，但是降低的變化不顯著(P>0.05)；當不加入Cd2+時，XMT表達量的相對值隨著加入Zn2+濃度的上升而逐漸升高；當Zn2+的濃度為1mg/L時，Cd2+濃度為2mg/L時的XMT表達量比濃度為1mg/L時低。3.建立了馬氏珠

6、母貝MT基因表達與Cd2+、Zn2+間關系的模型方程(方程中C代表Cd2+，Z代表Zn2+)：
　　SMT、XMT表達模型的決定系數(shù)均為0.9999，表明模型的擬合度極高，模型選擇恰當，可用于預測Cd2+、Zn2+對馬氏珠母貝MT基因表達的影響。
　　采用中心復合設計(Central composite face-centered, CCF)和響應曲面法在實驗室條件下研究了溫度、鹽度對馬氏珠母貝 MT基因表達的影響。溫度(T

7、)、鹽度(S)的范圍分別為20-32℃、20-36‰。試驗結果表明：1.溫度對馬氏珠母貝鰓 MT基因表達的相對值影響極顯著(P<0.01)，鹽度對馬氏珠母貝鰓MT基因表達的相對值影響不顯著(P>0.05)；溫度與鹽度兩因子的一次效應互作和高級互作對馬氏珠母貝鰓MT基因表達的相對值影響都極顯著(P<0.01)。2.建立了馬氏珠母貝MT基因(MT)表達與T、S間關系的模型方程：
　　MT表達模型的決定系數(shù)為0.9999。表明模型的擬合