絨山羊皮膚絨毛生長期與靜息期基因差異表達(dá)的研究.pdf

1、本項研究采用第二代超高通量DNA測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，對來源于內(nèi)蒙古阿爾巴斯型白絨山羊的絨毛生長期與靜息期三個皮膚部位的樣本進(jìn)行了深度的轉(zhuǎn)錄組測序，并運用denovo的方法對其皮膚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行從頭組裝，隨后對這兩個時期所出現(xiàn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了深入系統(tǒng)的分析，以便更加深入地了解絨山羊絨毛生長的分子機理，找出潛在的可能與絨毛生長相關(guān)的基因，為今后進(jìn)一步進(jìn)行功能驗證提供理論依據(jù)。
　　1.絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組的高通量測序及denov

2、o組裝及組裝效果評估
　　在絨山羊絨毛生長期和靜息期分別取兩只雌性阿爾巴斯絨山羊個體的腹部、體側(cè)和背部皮膚共計6個樣本，進(jìn)行RNA-Seq文庫的構(gòu)建和Illumina/Solexa高通量測序。共得到2億8千多萬條100bp的讀段，從頭組裝得到57，568條長度大于300bp的轉(zhuǎn)錄本序列。這些轉(zhuǎn)錄本序列長度總和達(dá)到53Megabase，平均長度928bp，N50長度1，397bp。將57，568條轉(zhuǎn)錄組序列與NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)

3、庫進(jìn)行比對，其中有24，640條為陽性。隨后對轉(zhuǎn)錄組序列的蛋白質(zhì)編碼區(qū)進(jìn)行從頭預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)24，058個蛋白質(zhì)編碼序列。從頭預(yù)測的蛋白質(zhì)編碼序列數(shù)量與比對到數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量非常接近。對隨機挑選的10條預(yù)測出具有全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)但在數(shù)據(jù)庫中沒有同源物的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行RT-PCR和Sanger測序以驗證轉(zhuǎn)錄組的組裝效果，發(fā)現(xiàn)有9條序列的PCR結(jié)果為陽性，并且Sanger測序結(jié)果與denovo組裝后的序列比對后均存在98％以上

4、的相似度。此外，將用于denovo組裝的短序列重新定位回57，568條轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)88.1％的序列可以發(fā)生單一定位，而其中的92.4％又屬于配對定位。以上結(jié)果表明組裝得到了較長、質(zhì)量可靠且較全面的絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組序列。
　　2.基于從頭組裝轉(zhuǎn)錄組序列的絨山羊不同絨毛生長時期皮膚轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析
　　基于從頭組裝的轉(zhuǎn)錄組序列，我們對相同部位不同絨毛生長時期的文庫進(jìn)行配對，并構(gòu)建了每個文庫的基因表達(dá)譜。隨后的差異基因表

5、達(dá)分析共獲得5，501條具有生物學(xué)重復(fù)的、一致性較好的差異表達(dá)基因。以絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組為背景分別進(jìn)行差異表達(dá)基因的KEGG、KOG和GO的富集性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的胞外基質(zhì)組分和細(xì)胞骨架蛋白編碼基因出現(xiàn)在差異表達(dá)基因里，這些基因主要涉及胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑連接、間隙連接等通路中，揭示在絨毛生長過程中細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用對絨毛生長是必須的。此外，很多信號通路中的生長因子以及受體都被鑒定為差異表達(dá)基因，并且在絨毛

6、生長期相對于靜息期是高表達(dá)基因。這些基因中很多都被證明是小鼠的毛囊建成以及發(fā)育所必須的。此外，對8個差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗證，結(jié)果顯示qPCR與高通量測序結(jié)果存在很高一致性，表明轉(zhuǎn)錄組測序得到的差異表達(dá)基因是可靠的。
　　3.基于山羊基因組的不同絨毛生長時期皮膚基因差異表達(dá)分析及與前者的比較
　　基于最新測序的云南黑山羊基因組序列，我們對絨毛生長期和靜息期的皮膚樣本進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。經(jīng)過文庫配比對對及進(jìn)一步的數(shù)據(jù)交