1、本試驗根據(jù)Genbank上發(fā)布的山羊MLPH基因的CDS序列(EU332403)設計引物進行擴增,擴增長度為104bp。查閱文獻選擇持家基因GAPDH作為內(nèi)參基因進行擴增,擴增長度為107bp。用實時熒光定量的方法,通過Bio-Rad iQ5軟件得到的初始濃度,運用相對定量的2-ΔΔCt分析方法計算得到了MLPH基因在山羊不同被毛顏色皮膚組織中mRNA的差異表達量為:白色(1.000)>黑色(0.204)>棕色(0.094)。結果看出,
2、白色中MLPH基因的表達量最多,黑色次之,棕色最少。所得數(shù)據(jù)運用SPSS17.0軟件的單因素方差分析進行差異顯著性分析,結果顯示白色與其他兩種被毛顏色之間差異顯著(P<0.05)。推測山羊被毛顏色表現(xiàn)為白色是“上位白“座位Ⅰ和MLPH基因協(xié)同作用的結果;MLPH基因無論與MSHR基因作用,還是與Agouti基因作用均為拮抗作用。
根據(jù)本課題組所測得的在Genbank上發(fā)布的山羊MLPH基因部分序列(EU316218),分別
3、在內(nèi)含子7部分序列、內(nèi)含子14和外顯子15部分序列設計兩對引物進行擴增,擴增長度分別為516bp和791bp。在這兩條擴增片段上,均發(fā)現(xiàn)了多個突變位點。因此用直接測序法對本實驗室保存的四個山羊品種120個個體進行擴增測序,運用PopGene32、DNAsp、SPSS17.0和MAGE5.05軟件進行群體遺傳學分析。更進一步分析測得的突變位點與MLPH基因的關系。
在山羊MLPH基因內(nèi)含子7部分片段上發(fā)現(xiàn)了6個突變位點,分別
4、為g.G8067C,g.T8068C, g.C8104G, g.G8151A, g.A8352G, g.A8362G。其中g.G8067C和g.T8068C,g.A8352G和g.A8362G分別表現(xiàn)出完全連鎖現(xiàn)象。位點g.G8067C和g.T8068C分析得到兩個單倍型GT(65.8%)和CC(34.2%),位點g.A8352G和g.A8362G分析得到兩個單倍型AA(76.2%)和GG(23.7%)。位點g.G8067C、g.T80
5、68C、g.G8151A、g.A8352G、g.A8362G均與山羊毛色稀釋基因MLPH基因有關。6個突變位點的綜合分析得到濟寧青山羊與遼寧絨山羊親緣關系較近,而與雷州黑山羊親緣關系較遠,聚類結果與地理位置均符合分析結果。
在山羊MLPH基因內(nèi)含子14和外顯子15部分片段上共發(fā)現(xiàn)7個突變位點,內(nèi)含子14上6個,分別為g.G16669T,g.T16710A,g.C16711A,g.A16761G,g.C17041T,g.G1