成年絨山羊皮膚干細(xì)胞的分離、純化、鑒定與誘導(dǎo).pdf

1、本研究旨在建立絨山羊皮膚干細(xì)胞的分離、純化培養(yǎng)體系，并對(duì)其特性和分化潛能進(jìn)行進(jìn)一步探討，以便為今后利用皮膚干細(xì)胞進(jìn)行絨山羊毛囊的定向調(diào)控提供科學(xué)的理論依據(jù)。 選擇健康成年絨山羊背部皮樣，經(jīng)中性蛋白酶4℃消化過夜，分離表皮和毛囊，用胰酶消化后解離細(xì)胞，再用Ⅳ型膠原粘附法對(duì)消化細(xì)胞進(jìn)行篩選分離，經(jīng)Ⅳ型膠原粘附10min的絨山羊皮膚干細(xì)胞直徑較小，核質(zhì)比較大，培養(yǎng)過程中能夠形成鳥巢狀、島狀和鋪路石狀等不同形狀的細(xì)胞克隆，而且在傳代的過

2、程中，大多數(shù)細(xì)胞始終維持在G1/G0期，各代克隆形成率也比較高，部分細(xì)胞表達(dá)K15、K19、p63、CD34和β1-hategrin，這些結(jié)果表明Ⅳ型膠原粘附篩選的細(xì)胞中包含有干細(xì)胞。 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇生長狀態(tài)良好的Ⅳ型膠原粘附后的第二代皮膚細(xì)胞作為克隆純化的對(duì)象細(xì)胞，利用96孔板有限稀釋法獲得了形態(tài)較為原始，直徑約為10μm的單細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)，該細(xì)胞能夠形成典型的全克??；而且，隨傳代次數(shù)增加，大多數(shù)細(xì)胞仍處于G1/G0

3、期，保持著干細(xì)胞的慢周期性，有較高的克隆形成率，始終具有較大的增殖潛能和克隆遺傳力：各代細(xì)胞冷凍復(fù)蘇率與24小時(shí)貼壁率差異不顯著(p<0.05)；大多數(shù)細(xì)胞的K15、K19、p63、CD34和β1-integrin等表面標(biāo)志鑒定結(jié)果均呈陽性，分化標(biāo)志K10和Involucrin檢測結(jié)果呈陰性。在體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，這些純化的干細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)生成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞，具有跨胚層分化潛能。以上結(jié)果充分證明了純化的細(xì)胞就是絨山