山羊皮膚干細(xì)胞及綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染研究.pdf

1、表皮干細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合過程中扮演著重要角色，目前利用表皮干細(xì)胞進(jìn)行組織重建和轉(zhuǎn)基因研究成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要方向。綠色熒光蛋白(GFP)是細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的標(biāo)記性蛋白質(zhì)之一，不用加外源底物就能在活細(xì)胞中直接觀察基因是否表達(dá)。本試驗(yàn)從山羊皮膚干細(xì)胞分離培養(yǎng)、生物學(xué)性特性鑒定、可塑性及GFP基因轉(zhuǎn)染四個(gè)方面進(jìn)行研究，為皮膚干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。 1.山羊皮膚干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)法：浸洗、抗菌處理后，將

2、皮膚切成0.1cm×0.1cm左右的小塊，表皮面朝上貼于鋪有0.1％明膠的培養(yǎng)皿中，加少量培養(yǎng)液浸潤，2h后用HDMEM/F12(3∶1)+20％血清+5μg/mL胰島素+0.5μg/mL氫化可的松+100單位雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)，3日換液一次。有細(xì)胞脫出后把血清體積分?jǐn)?shù)換為10％進(jìn)行培養(yǎng)。 DispaseⅡ酶消化法：浸洗、抗菌處理后將皮膚塊切割成0.5cm×1cm左右的條狀，在含4mg/mLDispaseⅡ酶的小瓶中4℃冷消化16h

3、。分離表皮與真皮，將表皮剪成糜狀，0.25％胰酶37℃消化5-7min后中和，過濾，離心，接種。用HDMEM/F12(3∶1)+10％血清+5μg/mL胰島素+0.5μg/mL氫化可的松+10ng/mLEGF+雙抗100μg/mL培養(yǎng)液培養(yǎng)。 胰酶消化法：浸洗、抗菌處理后將皮膚塊切割成0.5cm×1cm左右的條狀，用0.25％胰酶40C冷消化12h。分離表皮與真皮。將表皮剪成糜狀，過濾，接種。 組織塊培養(yǎng)法簡單易行，組織

4、塊可重復(fù)利用，但原代細(xì)胞脫出時(shí)間較長，平均8d，需15d以上才能傳代，原代傳代通常采用差別消化法。季節(jié)對細(xì)胞脫出時(shí)間、原代傳代時(shí)間、傳代數(shù)有顯著影響。春夏季細(xì)胞遷出時(shí)間(4.9±1.4d)和原代細(xì)胞傳代時(shí)間(10.3±2.5d)比秋冬季短(10±1.5d，20.3±1.7d)，傳代數(shù)(7.4±3.5代)比秋冬季多(4.5±1.5代)；DispaseⅡ酶消化法周期短，8d左右即可傳代，細(xì)胞平均傳代次數(shù)為6.5代。不同季節(jié)所得細(xì)胞無顯著差異

5、。但處理麻煩。用本法最高傳14代仍無明顯分化。胰酶消化法分離細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)活力很差，難以長期傳代，平均僅傳3.2代。與組織塊培養(yǎng)法、DispaseⅡ酶消化法在傳代數(shù)上均差異極顯著(p＜0.01)。 2.山羊皮膚干細(xì)胞的生物學(xué)特性 顯微鏡下觀察可見細(xì)胞胞體透亮、體積小、球形、致密，核質(zhì)比高，數(shù)日后呈鑲嵌多角形，鋪路石樣生長，存在典型克隆團(tuán)，有時(shí)出現(xiàn)PGCs樣集落。 分離培養(yǎng)的細(xì)胞體外增殖能力強(qiáng)，增殖能力下降。目前已傳至

6、第14代。細(xì)胞貼壁能力對黏附底物依賴性強(qiáng)，有無底物細(xì)胞貼壁率差異顯著，細(xì)胞在不同底物上生長貼壁率差異不顯著。培養(yǎng)至第10d時(shí)，第3代細(xì)胞克隆形成率在30％以上.以接種50個(gè)細(xì)胞的克隆形成率最高，為36％。細(xì)胞表達(dá)皮膚干細(xì)胞標(biāo)志α6整合素，β1整合素，角蛋白K19，P63轉(zhuǎn)錄因子，CD71轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，證實(shí)分離的細(xì)胞為皮膚干細(xì)胞。同時(shí)表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志OCT-4轉(zhuǎn)錄因子。成功地進(jìn)行液氮冷凍保存并復(fù)蘇，第3代細(xì)胞解凍后細(xì)胞活力在80％以上。

7、 3.皮膚干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化 1.用1μmol/L、5μmol/L5-氮胞苷處理表皮干細(xì)胞24h后繼續(xù)用B液培養(yǎng)，10d后部分細(xì)胞可分化為心肌樣細(xì)胞，α-actin抗體染色檢測陽性。 2.表皮干細(xì)胞用1mmolβ-Me預(yù)誘導(dǎo)24h和5mmolβ-Me正式誘導(dǎo)4h后，分化出神經(jīng)細(xì)胞，表達(dá)NSE,NF-200等神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志。 3.表皮干細(xì)胞在Vc、β-磷酸甘油和地塞米松誘導(dǎo)24小時(shí)后，出現(xiàn)大量針尖大小的圓形細(xì)

8、胞。18d后AKP染色陽性，茜素紅染色陽性。 4.皮膚干細(xì)胞的GFP基因轉(zhuǎn)染 1.100mg/LG418培養(yǎng)KSC，10d時(shí)細(xì)胞絕大部分死亡，篩選時(shí)增加一個(gè)濃度梯度用G418150mg/L濃度進(jìn)行篩選。 2.轉(zhuǎn)染24h后熒光顯微鏡下顯示綠色熒光強(qiáng)陽性，72h時(shí)熒光強(qiáng)度最大。 3.DNA濃度為1.6μg/mL，LipofectamineTM2000為4μL時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)30％。 4.MTT測定