毛囊生長期毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫的構(gòu)建及篩選.pdf

1、毛囊有許多有益的生物學(xué)功能,具有重要的心理社會學(xué)作用,脫發(fā)或多毛癥會給患者帶來沉重的精神負(fù)擔(dān)甚至心理障礙.對毛囊生物學(xué)及病理學(xué)的深入研究對今后建立毛發(fā)疾病治療的新方法具有指導(dǎo)意義.毛囊周期性進(jìn)行以下階段:器官生長和毛干形成(生長期)、器官退化(退行期)和相對的靜止?fàn)顟B(tài)(休止期).毛囊高度發(fā)育的特性,特別是它所具有的周期生長能力,引起生物學(xué)專家的濃厚興趣,毛囊的生長周期是凋亡和分化、毛囊周圍蛋白水解和基質(zhì)重建以及毛囊黑素合成高度協(xié)調(diào)的結(jié)果

2、.毛囊上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞即毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞與毛乳頭細(xì)胞的相互作用調(diào)控著其生長周期.毛囊從休止期向生長期轉(zhuǎn)換時,毛囊隆突部的干細(xì)胞在毛乳頭細(xì)胞的作用下被激活增殖,此過程是一個獨特的器官再生現(xiàn)象. 目前對生長期毛囊的研究主要集中在細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)和炎性細(xì)胞浸潤等方面,而對毛囊生長期基因的表達(dá)變化所知甚少.因為每個毛囊都有自己固有的生長節(jié)律,其生長周期是非同步的,所以研究毛囊周期的主要障礙是缺乏三個生長階段的模型,特別是其生長期和休止期.許

3、多證據(jù)表明斑禿是研究毛發(fā)生長周期的理想模型,斑禿的最早臨床表現(xiàn)為休止期脫發(fā),呈局限性離心性向外發(fā)展.Eckert 等認(rèn)為斑禿發(fā)病過程是生長期毛囊成批的提前進(jìn)入休止期造成的,在已形成的禿發(fā)斑中主要是休止期毛囊,說明毛囊向生長期發(fā)展的過程受到阻礙.因此,可將非斑禿區(qū)和斑禿區(qū)毛囊分別作為生長期和休止期毛囊模型,研究毛囊生長期的基因調(diào)控機制.通過對許多生物學(xué)過程中基因表達(dá)水平變化的研究,可有效揭示此過程的遺傳學(xué)本質(zhì).檢測正常組織和異常組織之間差

4、異表達(dá)基因的方法有許多種,如差異顯示技術(shù)(DD)、表達(dá)序列標(biāo)簽法(EST)、消減雜交法和基因表達(dá)的系列分析(SAGE),最近建立的微陣列技術(shù)更是引起人們濃厚興趣,在人類疾病狀態(tài)的研究中仍有很高應(yīng)用前景.盡管如此,這些方法過程繁瑣,需要昂貴的設(shè)備,而且需要大量mRNA,臨床標(biāo)本尤其是毛囊由于取材量少很難達(dá)到要求.最近的研究表明,在種類上,稀有mRNA(在細(xì)胞中少于5個拷貝)在整個轉(zhuǎn)錄子中占大多數(shù),但在量上只占總轉(zhuǎn)錄子的一小部份,而少數(shù)高表

5、達(dá)的基因是總轉(zhuǎn)錄子的主要組成部份.需要強調(diào)的是即使低表達(dá)豐度的基因也同樣具有重要的生物學(xué)功能.一般認(rèn)為在一個細(xì)胞中有大約2萬個基因表達(dá),應(yīng)用SAGE或高密度微陣列的研究表明,在腫瘤與正常組織表達(dá)豐度變化超過10倍的基因只占mRNA種類的0.5~2﹪ . 本研究中,采用SMART cDNA合成技術(shù)合成的兩組cDNA電泳條帶非常相似,也說明兩種狀態(tài)的細(xì)胞mRNA差異非常小.抑制性消減雜交技術(shù)(uppression subtractive h

6、ybridization, SSH)可高度敏感的檢測到低豐度的差異表達(dá)基因,因為它具有正?；?normalization)的作用,通過兩次削減雜交和兩次抑制性PCR使每種cDNA的量相對平衡,這樣就避免了對高豐度基因的優(yōu)先篩選,因此相對于傳統(tǒng)的篩選方法可高度敏感的篩選低表達(dá)的基因,而且通過SSH還有可能發(fā)現(xiàn)新基因,同時SSH具有更強的可操作性,在很大程度上克服了假陽性高、工作量大的缺點.另外大量研究表明,采用SMART<'TM> cDN

7、A 合成技術(shù)可從少量的RNA合成完整的cDNA文庫,明顯優(yōu)于普通的RT-PCR.毛乳頭細(xì)胞位于毛囊底部,它在毛囊形成、毛發(fā)生長和毛發(fā)周期轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用.從Oliver的研究開始,毛乳頭所固有的誘導(dǎo)毛囊形成的特性得到了多次證明.即使將體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞移植入正常皮膚,仍然具有誘導(dǎo)毛發(fā)生長作用.我們已建立了高效簡便分離毛乳頭細(xì)胞的方法,并用于毛發(fā)生長研究,為了進(jìn)一步闡明毛發(fā)周期調(diào)控的分子機制,我們以斑禿作為模型,采用抑制性消減雜交技術(shù)及

8、SMART cDNA合成技術(shù)篩選生長毛囊期毛乳頭細(xì)胞的差異表達(dá)基因.由于Northern印跡需要大量的mRNA,不適用于小量的臨床標(biāo)本,所以本實驗用反向Northern替代了Northern印跡,對所篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證,此方法的特異性與Northern雜交接近,敏感性高于標(biāo)準(zhǔn)的Northern雜交.本實驗的主要研究結(jié)果如下:(1)兩步酶消化法是一種快速、簡單、經(jīng)濟的分離培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞的方法.我們針對斑禿區(qū)生長期毛囊及禿發(fā)區(qū)休止期

9、毛囊的不同特點,對分離方法作了相應(yīng)的改進(jìn),成功的分離到高純度的生長期及休止期毛囊的毛乳頭.(2)毛乳頭細(xì)胞在毛囊周期中起關(guān)鍵作用,其基因表達(dá)水平的變化可能在毛發(fā)生長周期中起著重要作用.本研究中為了從斑禿的臨床標(biāo)本中篩選差異表達(dá)基因,我們以斑禿為模型,采用SSH和SMART cDNA 合成技術(shù)成功的建立了毛囊生長期毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫.盡管在以往很多研究中采用SSH成功地從其它組織不同的病理狀態(tài)下分離出了差異表達(dá)的基因,但本實驗是第

10、一次研究生長期毛乳頭細(xì)胞基因表達(dá)變化.(3)通過測序和BLAST同源性搜索,共找到42個在生長期毛乳頭細(xì)胞高表達(dá)的基因.這些克隆可分為:功能已知基因和功能未知基因.大多數(shù)功能已知基因按功能屬于核酸合成、細(xì)胞周期和生長調(diào)節(jié)、蛋白合成、能量代謝、細(xì)胞角蛋白和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)等相關(guān)的基因,其中包括17-β羥基類固醇脫氫酶、Dermatopontin、屬于金屬蛋白酶家族的ADAMTS4、核糖核酸酶/血管生成素抑制基因、鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白、Stann

11、iocalcin-1等,另外還有14個功能未知基因.這些差異表達(dá)基因均通過反向Northern進(jìn)行了驗證,以上基因的發(fā)現(xiàn)對闡明毛發(fā)生長周期中分子遺傳學(xué)調(diào)控機制具有重要意義,通過對基因文庫的進(jìn)一步篩選和研究有可能從中找到更多的毛發(fā)生長調(diào)控基因和生長期標(biāo)志蛋白,并對今后建立毛發(fā)疾病治療的新方法具有指導(dǎo)意義.總之,我們第一次建立了用SSH方法分離毛囊生長期毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因的方法,證明SSH技術(shù)可用于小量的臨床標(biāo)本篩選未知的差異表達(dá)基因,