苧麻炭疽病菌的分離鑒定及抗病基因文庫的構(gòu)建.pdf

1、苧麻(Bochmeria nivea L.)為蕁麻科(Vrticaceae)苧麻屬(Bochmeria)多年生宿根性韌皮纖維作物。苧麻炭疽病(Colletotrichum spp.)是苧麻上發(fā)生普遍而嚴(yán)重的病害之一,一般發(fā)病率為20％～40％,重的病葉率、病情指數(shù)分別達(dá)90％、55.0％,可造成纖維損失10％左右。國內(nèi)外有關(guān)苧麻炭疽病的研究報(bào)道比較少,尤其是國外。在中國,苧麻炭疽病的研究大多集中在上世紀(jì)八九十年代。因?yàn)樘烤揖鷮俜诸愊到y(tǒng)上

2、發(fā)生過變化,所以作為引起苧麻炭疽病的病原需要重新確認(rèn)。解析苧麻炭疽病病菌的分類地位、生物學(xué)特性以及苧麻受炭疽病誘導(dǎo)后的抗病防御反應(yīng)機(jī)理,對創(chuàng)建具廣譜持久的抗炭疽病材料,以及從苧麻中克隆抗病基因等具有重要意義。
　　 本研究的主要內(nèi)容為:分離和鑒定苧麻炭疽菌病病原,對病原菌的生物學(xué)特性及多態(tài)性進(jìn)行研究；應(yīng)用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建病原誘導(dǎo)后特異表達(dá)的cDNA文庫；從該SSHcDNA文庫中篩選出與苧麻抗病相關(guān)的特異表達(dá)和增強(qiáng)表

3、達(dá)的基因片段；通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索,獲得差異表達(dá)片段可能的生物學(xué)信息。最后進(jìn)一步分析和推測這些片段在抗病反應(yīng)中的作用和與抗病的關(guān)系。了解苧麻炭疽病水平抗性所涉及的信號傳導(dǎo)、參與抗病相關(guān)基因的表達(dá)種類與數(shù)量。初步建立苧麻炭疽病病水平抗性相關(guān)基因的表達(dá)譜:為后續(xù)基因克隆、基因功能和抗病機(jī)理的深入研究建立技術(shù)平臺(tái)。
　　 取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.本研究從幾個(gè)苧麻主產(chǎn)區(qū)(湖北武漢、湖北咸寧、湖南長沙、江西宜春

4、和四川達(dá)州)采集炭疽病菌感染組織。已經(jīng)成功分離到苧麻炭疽病菌株89個(gè),分別為:湖北武漢20個(gè),咸寧24個(gè),江西18個(gè),湖南長沙21個(gè),四川達(dá)州6個(gè)。通過形態(tài)學(xué)和分子鑒定(ITS區(qū)序列,β-tubulin序列和Actin序列的克隆)最后初步鑒定出苧麻炭疽菌病原為Colletotrichum gloeosporioides,C.fructicola,C siamense和Chigginsianum。
　　 2.用UPGMA平均聚類法

5、對45個(gè)分離自各產(chǎn)區(qū)的苧麻炭疽菌菌株進(jìn)行RAPD聚類分析,發(fā)現(xiàn)不同地域間和同一地域里,苧麻炭疽菌菌株間存在豐富的遺傳多樣性。在相似水平60％,供試菌株可以分為兩大類:第一類,WH-4、XN2-1、XN2-4。第二類,WH-1、WH-9、WH-A、WH-B、WH-C、WH-D、WH-H、WH-J、JB-1、XN1-1、XN1-6、XN2-1、XN2-4、XN3-3、XN3-4、XN4-1、XN5、JX-1、JX-4、JX-6、JX-12、

6、JX-14、JX-15、JX-16、JX-17、JX—18、JX-19、DZ-2、DZ-3、DZ-4、DZ-5、DZ-6、HN-1、HN-2、HN-3、HN-7、HN-8、HN-9、HN-12、HN—13。
　　 3.代表性菌株HN-3(Colletotrichum gloeosporioides)生物學(xué)特性研究表明,菌絲在20～30℃之間可以生長,最適溫度為25℃。分生孢子在20℃～30℃之間產(chǎn)量較高,28℃達(dá)到最高。菌絲在p

7、H4.0-10.0均能生長,在PDA、PSA和苧麻葉片培養(yǎng)基上生長最快。在牛肉膏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多。菌絲對各種碳源的利用率都很高。其中對麥芽糖的利用效果最好。產(chǎn)孢方面,相同的氮源,碳源不同其產(chǎn)孢量差異很大,硝酸鉀和葡萄糖的結(jié)合可以誘導(dǎo)大量孢子的產(chǎn)生,添加硝酸鈣菌絲生長最快,在酵母膏為氮源的培養(yǎng)基里菌落直徑較小,但是孢子數(shù)目巨大。維生素B2液體培養(yǎng)基里可以產(chǎn)生最多的生物量,同時(shí)也可以誘導(dǎo)大量分生孢子的產(chǎn)生。菌落在12小時(shí)光暗交替條件下生長最

8、快,但是孢子產(chǎn)量卻最低,而連續(xù)黑暗培養(yǎng)更利于孢子的生成。
　　 4.用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了一個(gè)富集炭疽病抗性相關(guān)基因片段的差減文庫。應(yīng)用反向Northern技術(shù)對該差減文庫進(jìn)行了篩選。篩選出的差異表達(dá)克隆經(jīng)測序后合并為132個(gè)代表不同基因的EST片段。檢索結(jié)果表明,在能找到與之對應(yīng)的EST序列中,就EST來源來看,得分最高的一大部分來源于楊屬、李屬、蓖麻、葡萄樹,其他也有來自大豆和長春花等。本實(shí)驗(yàn)所得到的所有ESTs

9、,都沒有在苧麻中報(bào)道過?？共〖胺烙嚓P(guān)序列最多,為37條,占28％；未分類序列23條,占17％；未明確分類序列有15條,約占11％；轉(zhuǎn)錄相關(guān)10條,占8％:轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)和代謝相關(guān)都是7條,占5％；細(xì)胞生長及分化、蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)座子相關(guān)各有6條,占4％,另外還有與胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的4條、能量相關(guān)的3條、信號傳導(dǎo)相關(guān)的3條、蛋白質(zhì)降解及貯藏相關(guān)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的2條和次生代謝相關(guān)序列有1條。其中抗病相關(guān)基因中包括來自白楊樹受銹病誘導(dǎo)的SSH文庫的相關(guān)