EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的人毛囊和毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及HIF-1α在人毛囊和毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)的研究.pdf

1、毛囊是哺乳動(dòng)物特有的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的皮膚附屬器官，是一個(gè)富含干細(xì)胞，由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的系統(tǒng)。一生不斷經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和休止期的周期性循環(huán).毛乳頭對(duì)誘導(dǎo)和維持毛囊的周期性循環(huán)必不可少，其大小決定了毛囊的大小和生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短。毛乳頭細(xì)胞具有確定和維持毛母質(zhì)細(xì)胞增殖分化的作用，而毛球部毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖分化是毛囊周期性生長(zhǎng)調(diào)控的關(guān)鍵。與其他組織器官的再生一樣，上皮細(xì)胞與相應(yīng)間質(zhì)細(xì)胞間的相互作用在毛囊的周期性生長(zhǎng)調(diào)控中具有重要意義。

2、 綠茶是一種全世界受到廣泛歡迎的飲料，EGCG是綠茶茶多酚的主要活性成分之一，具有廣泛的生物學(xué)活性，已有大量研究表明其具有清除氧自由基抗氧化、抗腫瘤及對(duì)紫外線輻射的光保護(hù)等作用[1].但EGCG對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)及毛乳頭細(xì)胞增殖的影響國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道。 低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible faCtot-1，HIF-1)是1992年由Semenza[2]在Hep3B細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種DNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控多種基因的

3、表達(dá)。其中HIF-1α是專一調(diào)節(jié)O2的HIF-1亞單位，決定了HIF-1的活性，它與靶基因結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，使機(jī)體產(chǎn)生一系列低氧適應(yīng)反應(yīng)?，F(xiàn)已證實(shí)HIF有調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成、鐵代謝、血管形成和葡萄糖代謝等多種作用，同時(shí)隨著對(duì)HIF-1α研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞生長(zhǎng)的各種應(yīng)答機(jī)制有密切的關(guān)系[3]。 由于毛囊生長(zhǎng)的關(guān)鍵部位(毛球部)深埋于真皮深層，皮膚表面的局部用藥很難滲透到毛球部，而成纖維細(xì)胞緊鄰表皮下方，并包裹在毛囊周?chē)?。我們研?/p>

4、小組前面的研究中已經(jīng)做到將目的基因HIF-1α通過(guò)脂質(zhì)體直接導(dǎo)入成纖維細(xì)胞，導(dǎo)入后在毛囊周?chē)某衫w維細(xì)胞表達(dá)弄口分泌某些關(guān)鍵因子，如VEGF，F(xiàn)GF等，從而發(fā)揮促毛發(fā)生長(zhǎng)的作用，達(dá)到治療毛發(fā)疾病的目的。作為該課題的一部分，本實(shí)驗(yàn)證明了HIF-1α在毛囊和培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步為研究HIF-1α促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的機(jī)理提供了理論依據(jù)。 本課題的研究主要包括以下兩部分： (一)EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的人毛囊和毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)

5、活性的影響顯微分離人毛囊，在加入不同質(zhì)量濃度EGCG(0～250 mg/L)的WIlliams E培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察毛囊生長(zhǎng)情況；利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，加入不同質(zhì)量濃度的EGCG(0～500 mg/L)，48h后，利用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組比較，0.1，1mg/L的EGCG對(duì)體外培養(yǎng)的毛囊生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用(P<0.05)；MTT顯示15.6，31.2，62.5 mg/L

6、的EGCG能夠明顯促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)7.8，15.6，31.2和62.5 mg/LEGCG作用48h后，S期和G2/M期細(xì)胞比率明顯增加，G0/G1期細(xì)胞比率明顯減少，細(xì)胞增殖指數(shù)明顯增加(由5.25％增至5.64％，14.61％，32.51％，37.35％)，細(xì)胞增殖指數(shù)與EGCG濃度呈顯著正相關(guān)(r=0.933).因此，我們得出結(jié)論一定濃度的EGCG能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的人毛囊生長(zhǎng)及人毛乳頭細(xì)胞增殖。

7、 (二)HIF-1α人毛囊和毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)分離完整的人生長(zhǎng)期毛囊，提取總RNA，RT-PCR法檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)。利用兩步酶法分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞，取第三代毛乳頭細(xì)胞，分為正常培養(yǎng)組和200μM氯化鈷處理組。提取總RNA，RT-PCR法檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)；提取細(xì)胞總蛋白，用Western blot法檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)；用免疫熒光法進(jìn)一步檢測(cè)人毛乳頭細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)并定位

8、。RT-PCI濕示人毛囊及分離培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞均表達(dá)HIF-1α mRNA。Western blot顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細(xì)胞表達(dá)HIF-1α蛋白，正常培養(yǎng)組未能檢測(cè)到HIF-1α蛋白。免疫熒光顯示200μM氯化鈷處理的人毛乳頭細(xì)胞胞漿、胞核中均有HIF-1α蛋白的表達(dá)，正常培養(yǎng)組未能檢測(cè)到HIF-1α蛋白。因此我們可以得出結(jié)論人毛囊和毛乳頭細(xì)胞均可表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子，但常氧下HIF-1α蛋白迅速降解，故免疫熒光、Wester