人毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞與雄激素相互作用的研究.pdf

1、研究背景 脫發(fā)是一種多原因引起的無年齡、無性別差異的疾病。盡管患者無明顯自覺癥狀，但因影響美觀而迫切要求治療。根據(jù)患者的情況和要求在臨床上多采用自體毛發(fā)移植的方法進(jìn)行治療，但在治療同時面臨著毛發(fā)供體來源不足、各個部位毛發(fā)供體生長情況不同等問題。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與毛發(fā)組織工程學(xué)為毛發(fā)移植提供了新的思路。毛囊的毛乳頭細(xì)胞因為其在毛囊的生長發(fā)育，周期調(diào)控及維持毛發(fā)生長中的主導(dǎo)作用而成為研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)毛乳頭細(xì)胞是通過分泌多種生長因子、

2、細(xì)胞因子來誘導(dǎo)毛囊的生長發(fā)育的，例如它分泌IGF-1、FGF-1、SCF、HGF、KGF等多種與毛囊形成有關(guān)的因子。毛乳頭細(xì)胞表面還存在多種特異性標(biāo)記，這些標(biāo)記與毛乳頭控制毛囊的生長發(fā)育有密切的關(guān)系。因此建立毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，詳盡地了解毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)生長特點(diǎn)，以及如何誘導(dǎo)毛囊的發(fā)生，無疑是研究毛乳頭細(xì)胞的重要方面。目前多采用膠原酶消化法分離毛乳頭，此法將分離的毛囊直接加膠原酶消化，在解剖顯微鏡下將毛乳頭撿出，顯著降低了勞動強(qiáng)度

3、，獲得了大量的毛乳頭細(xì)胞。但是毛乳頭細(xì)胞在培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)增殖緩慢，其誘導(dǎo)毛囊形成的能力隨培養(yǎng)時間而削弱，體外培養(yǎng)10代以上的毛乳頭細(xì)胞常常失去其誘導(dǎo)能力，從而限制了毛乳頭細(xì)胞的研究應(yīng)用。如何改進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)條件成為需要解決的一個問題。 外根鞘是毛囊結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它與皮膚基底層相延續(xù)，創(chuàng)面的愈合主要靠外根鞘細(xì)胞等附件上皮的增殖。作為毛囊上皮部分的外根鞘細(xì)胞也因為其在毛發(fā)循環(huán)中的相對穩(wěn)定受到了更多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)外根鞘細(xì)

4、胞減少或毀損可導(dǎo)致新的毛發(fā)周期的開始，將E6、E7乳頭病毒癌基因?qū)朕D(zhuǎn)基因小鼠的外根鞘細(xì)胞可延長毛發(fā)生長相、加速毛發(fā)生長并跳過休止期而連續(xù)生長。還有研究表明毛乳頭細(xì)胞對外根鞘細(xì)胞的誘導(dǎo)作用反映了毛囊真皮細(xì)胞與表皮細(xì)胞之間的相互作用。所以外根鞘細(xì)胞特性的研究對于闡明毛發(fā)的生長周期也具有重要的意義。 雄激素在體內(nèi)對毛發(fā)的生長發(fā)育起著一定的作用。毛囊組織中許多細(xì)胞均能分泌表達(dá)不同的雄激素代謝酶如5α-R，而且以毛乳頭作用為甚。而雄激素

5、對毛囊調(diào)節(jié)的主要功能之一就是調(diào)節(jié)毛乳頭的大小，因為毛發(fā)的粗細(xì)與毛乳頭的大小有關(guān)。免疫組化檢測胡須、腋毛及枕部頭皮的毛乳頭細(xì)胞中雄激素受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的胡須、腋毛的毛乳頭細(xì)胞中雄激素受體的表達(dá)較明顯，而枕部頭皮毛乳頭細(xì)胞無表達(dá)。在胡須和腋毛的毛乳頭細(xì)胞核中亦可檢測到雄激素受體，而枕部頭皮的毛乳頭細(xì)胞核中顯示微量的表達(dá)。這說明毛囊對雄激素的反應(yīng)性差異的可能與其部位以及表達(dá)的雄激素受體有關(guān)，在這個過程中毛乳頭細(xì)胞所起的作用成為需要研究的另

6、一個問題。 研究目的 本課題的研究目的是通過體外培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞，觀察總結(jié)人毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特點(diǎn)，改進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件。并且觀察不同濃度雄激素對體外培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞增殖活性的影響。 研究內(nèi)容 1.人頭皮毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。膠原酶消化二步法分離毛乳頭，使用含100mL/LFCS的DMEM培養(yǎng)基和DPCM培養(yǎng)基進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察比較人毛乳

7、頭細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)。α-SMA和Vimentin免疫組化染色鑒定毛乳頭細(xì)胞與成纖維細(xì)胞相區(qū)別。 2.人頭皮外根鞘細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。消化法獲得人毛囊外根鞘細(xì)胞，觀察外根鞘細(xì)胞在K-SFM培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特點(diǎn)。角蛋白19免疫組化染色鑒定外根鞘細(xì)胞與表皮細(xì)胞相區(qū)別。 3.雄激素(睪酮)對體外培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞的影響。采用脫發(fā)與非脫發(fā)成人頭皮標(biāo)本，分別培養(yǎng)得到兩種毛乳

8、頭細(xì)胞。采用非脫發(fā)成人頭皮標(biāo)本，培養(yǎng)得到外根鞘細(xì)胞。然后將不同的濃度睪酮加入兩種毛乳頭細(xì)胞與外根鞘細(xì)胞的共同培養(yǎng)基中，比較其對外根鞘細(xì)胞的增殖活性的影響。 研究結(jié)果 1.DPCM培養(yǎng)基可以使毛乳頭細(xì)胞長期維持較強(qiáng)的增殖潛能。毛乳頭細(xì)胞在DPCM培養(yǎng)基上的生長狀況明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基(含100mL/LFCS的DMEM)上的生長狀況，而且細(xì)胞傳代次數(shù)可達(dá)到18-20代。在細(xì)胞形態(tài)上，毛乳頭細(xì)胞與成纖維細(xì)胞類似，但呈凝集性生長

9、，α-SMA和Vimentin免疫組化染色陽性。 2.外根鞘細(xì)胞分化程度低，利用膠原來作為其細(xì)胞外基質(zhì)，可以促進(jìn)原代培養(yǎng)時細(xì)胞的黏附和貼壁。消化法獲得的人毛囊外根鞘細(xì)胞，在K-SFM培養(yǎng)基上具有較快的增殖活性，傳代次數(shù)可以達(dá)到10-12代。外根鞘細(xì)胞角蛋白19免疫組化染色呈陽性表達(dá)。 3.不同濃度睪酮對單獨(dú)培養(yǎng)的兩種毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞的增殖性均無作用(與對照組相比P＞0.05)。10-11mL/L濃度至10-8mL/

10、L濃度(與對照組相比P＜0.01)睪酮與非脫發(fā)患者的毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時可促進(jìn)外根鞘細(xì)胞增殖。而10-11mL/L濃度至10-7mL/L濃度(與對照組相比P＜0.01)睪酮與脫發(fā)患者的毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時，對外根鞘細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制作用。 研究結(jié)論 1.膠原酶消化二步法分離的人毛乳頭，通過體外原代培養(yǎng)可以快速、高效地獲得毛乳頭細(xì)胞。DPCM培養(yǎng)基較傳統(tǒng)的培養(yǎng)基(含100mL/LFCS的DMEM)對毛

11、乳頭細(xì)胞具有更顯著地刺激生長的作用。 2.毛乳頭細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的凝集性生長，而且α-SMA免疫組化染色呈現(xiàn)陽性，這些可以作為與成纖維細(xì)胞相鑒別的特性。 3.消化法獲得的人外根鞘細(xì)胞，在K-SFM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，預(yù)先使用膠原做基質(zhì)，可以傳10-12代。而且外根鞘細(xì)胞特異性表達(dá)角蛋白19。 4.睪酮與非脫發(fā)患者的毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時對外根鞘細(xì)胞的增殖作用同睪酮與脫發(fā)患者的毛乳頭細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時對外