輪狀病毒與宿主細(xì)胞相互作用的研究.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒屬，是一種無(wú)包膜的二十面體形狀病毒。RV衣殼由三層同心包裹的結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，核心含有一個(gè)由11個(gè)雙鏈RNA片段構(gòu)成的基因組，后者編碼12個(gè)病毒蛋白，包括6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-4，6，7)和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-6)。輪狀病毒具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，只能有效感染胃腸道上皮及腎上皮細(xì)胞。人和動(dòng)物的嬰幼個(gè)體對(duì)輪狀病毒普遍易感。然而，隨著年齡的增大，他們對(duì)RV的易感性也顯著降低。產(chǎn)生這種變化的原因

2、可能是在個(gè)體的生長(zhǎng)過(guò)程中，針對(duì)RV的某些宿主限制性細(xì)胞因子出現(xiàn)了表達(dá)。目前許多研究表明一些宿主蛋白例如APOBEC3G、Lv1、Ref1及EWI-2wint具有明顯的抑制病毒感染的作用，而這些宿主限制性因子的表達(dá)可增加宿主對(duì)病毒的抵抗能力，降低宿主的易感性。然而，在RV感染中，類似的具有抑制RV感染的宿主蛋白卻少有發(fā)現(xiàn)。如同在其它很多的病毒感染，在RV感染中，宿主蛋白的合成受到了廣泛的抑制。但是有研究發(fā)現(xiàn)，一些宿主蛋白如整合素α2β1、

3、β2及伴侶蛋白Grp78、Grp94在RV感染過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，并在RV的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明RV能夠選擇性促進(jìn)某些宿主蛋白的表達(dá)以保證病毒感染的順利進(jìn)行。相反，宿主細(xì)胞是否同樣可以通過(guò)上調(diào)一些抗RV的宿主蛋白的表達(dá)以抑制RV的感染呢?
　　 RV感染是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)5歲以下嬰幼兒急性脫水腹瀉的主要原因。RV腹瀉發(fā)生的確切的分子機(jī)制到目前為止仍然沒(méi)有定論。最初RV腹瀉被認(rèn)為是由于小腸絨毛頂部腸上皮細(xì)胞被RV感染后生

4、理功能受到破壞引起的。一些體外實(shí)驗(yàn)研究表明RV感染可以引起腸上皮細(xì)胞的凋亡和壞死。在對(duì)RV腹瀉動(dòng)物模型的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RV感染可以導(dǎo)致小腸粘膜發(fā)生病理改變及功能異常，其程度的輕重取決于。RV病毒株的毒力。然而，這種機(jī)制難以解釋為什么在RV腹瀉中常常發(fā)現(xiàn)腸道粘膜只有輕微的組織病理學(xué)改變且沒(méi)有腸上皮細(xì)胞的破壞的現(xiàn)象。其它一些研究發(fā)現(xiàn)，RV感染后腸上皮細(xì)胞刷狀緣相關(guān)的一些酶如蔗糖酶異麥芽糖酶(SI)、乳糖酶-根皮苷水解酶，二肽基肽酶Ⅳ(DP

5、PⅣ)、Na+-D-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(SGLT1)以及Na+L-丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)及活性的出現(xiàn)損害，由此推測(cè)RV感染導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞對(duì)葡萄糖和氨基酸的消化吸收能力減弱可能是RV感染引起腹瀉發(fā)生的一種可能的機(jī)制。但是這些研究都未能給出一個(gè)被廣泛接受的RV感染引起腹瀉發(fā)生的具體的分子機(jī)制。
　　 近年來(lái)，蛋白質(zhì)組技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病毒感染的研究之中，這對(duì)揭示病毒感染的病理生理機(jī)制，深化我們對(duì)病毒-宿主相互作用的認(rèn)識(shí)發(fā)揮了巨大作用。在本研究

6、中，我們通過(guò)蛋白質(zhì)組技術(shù)來(lái)發(fā)現(xiàn)新的RV宿主限制性因子以及探究RV腹瀉的新機(jī)制。本研究分為兩部分，第一部分采用二維凝膠電泳(2-DE)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的RV宿主限制因子，觀察宿主細(xì)胞的天然免疫機(jī)制是如何應(yīng)對(duì)RV感染的；第二部分則運(yùn)用一種先進(jìn)的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)SILAC來(lái)研究RV感染腸上皮細(xì)胞引發(fā)腹瀉的分子機(jī)制，觀察RV是如何破壞宿主的天然免疫屏障從而致病的。本研究將會(huì)加深對(duì)RV感染及RV與宿主細(xì)胞相互作用分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為RV腹瀉的預(yù)防和治療

7、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分：新的RV宿主限制性因子發(fā)現(xiàn)
　　 首先，我們確定了RV感染的合適時(shí)間和MOI以獲得最好的感染效果和細(xì)胞活力，這對(duì)隨后的二維凝膠電泳分析十分重要。為進(jìn)行二維凝膠電泳樣本的制備，我們將MA104培養(yǎng)在直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞完全匯合時(shí)，用用純化的人輪狀病毒W(wǎng)a株感染(moi=3)，同時(shí)用等量的DMEM作為對(duì)照感染。細(xì)胞感染12后用冷0.9％NaCl沖洗感染的細(xì)胞，蛋白裂解液提取細(xì)胞總

8、蛋白。采用13 cm ReadyStrip IPG膠條(非線性，pI3-10)在IPGphor電泳系統(tǒng)上進(jìn)行蛋白質(zhì)的等電聚焦。等電聚焦結(jié)束后，將膠條置于預(yù)先制好的12.5％聚丙烯酰胺凝膠上垂直電泳以進(jìn)行多肽分離。電泳結(jié)束后，用膠體藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色，并采用GS800掃描儀對(duì)染色后的凝膠進(jìn)行掃描，用PDQuest6.1軟件進(jìn)行圖像分析。我們選擇RV感染后表達(dá)顯著上調(diào)50％以上的蛋白點(diǎn)，通過(guò)MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白序列鑒定。結(jié)果顯示在

9、人RV Wa株感染的MA104細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)24個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)顯著上調(diào)50％以上，質(zhì)譜成功鑒定了其中16個(gè)蛋白點(diǎn)。在成功鑒定的蛋白點(diǎn)中，11個(gè)為宿主蛋白(10種)，5個(gè)點(diǎn)為病毒蛋白(4種)。我們隨機(jī)選取了一些宿主蛋白如ACP1、ALDOA、CYPA和KRT20對(duì)它們的表達(dá)采用Western blot和qRT-PCR等方法進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 其次，為了明確CYPA在RV感染中的作用，我們先進(jìn)行了免疫熒光實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RV感染MA1

10、04細(xì)胞后，CYPA與RV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP5出現(xiàn)顯著共定位，提示CYPA被招募到RV病毒粒質(zhì)。繼而我們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RV結(jié)構(gòu)蛋白VP2與CYPA能夠相互共沉淀，表明這兩種蛋白質(zhì)可能存在直接或間接的相互作用。在此基礎(chǔ)上為了進(jìn)一步明確CYPA是否對(duì)RV感染有抑制或促進(jìn)作用，我們?cè)谒拗骷?xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)野生型CYPA及其脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶功能缺失突變體CYPA/R55A，或干擾宿主細(xì)胞內(nèi)源性CYPA的表達(dá)，觀察這些處理對(duì)RV感染的影響。結(jié)果

11、顯示，過(guò)表達(dá)野生型CYPA顯著降低RV復(fù)制，而過(guò)表達(dá)CYPA/R55A會(huì)顯著促進(jìn)RV復(fù)制。降低內(nèi)源性CYPA表達(dá)同樣顯著促進(jìn)RV的復(fù)制。這些結(jié)果顯示CYPA可以通過(guò)其脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性抑制RV復(fù)制。同時(shí)，過(guò)表達(dá)CYPA及其酶功能缺失突變體CYPA/R55A均能降低宿主對(duì)RV的易感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CYPA還可以通過(guò)促進(jìn)宿主細(xì)胞IFN-I反應(yīng)來(lái)抑制RV感染，這種功能不依賴于其脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性但是可能依賴于宿主細(xì)胞JNK信號(hào)路徑的激活

12、。
　　 最后，由于新生BALB/c小鼠對(duì)RV非常易感，RV感染容易產(chǎn)生腹瀉癥狀。隨著日齡的增大(>2周)BALB/c小鼠對(duì)RV易感性顯著降低。為了明確小腸上皮細(xì)胞CYPA的表達(dá)是否與BALB/c小鼠對(duì)RV易感性的變化相關(guān)，我們比較了不同日齡段BALB/c小鼠小腸上皮細(xì)胞中CYPA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在新生小鼠(5日齡)CYPA僅在小腸絨毛底部，主要是在腸隱窩處上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)，而在RV容易感染到的小腸絨毛上部的上皮細(xì)胞中幾乎不見C

13、YPA的表達(dá)。相反，在稍大的BALB/c小鼠(15日齡)的小腸絨毛，不管是絨毛頂端還是基底部，其上皮細(xì)胞中CYPA均有豐富的表達(dá)。這些結(jié)果表明，新生BALB/c小鼠小腸絨毛上段上皮細(xì)胞中CYPA表達(dá)缺失可能是導(dǎo)致其對(duì)RV易感的重要原因。
　　 第二部分：RV感染腸上皮細(xì)胞引發(fā)腹瀉新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)
　　 首先，我們用人輪狀病毒(Wa株)感染人腸上皮細(xì)胞Caco-2，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入100μg/ml胰蛋白酶，以此模擬腸道消化性

14、的環(huán)境，觀察腸腔內(nèi)消化性環(huán)境對(duì)RV感染腸上皮細(xì)胞后果的可能影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在消化性環(huán)境中RV的感染會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞
　　 快速脫落。臺(tái)盼藍(lán)染色表明脫落的細(xì)胞活性良好，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示這些脫落的細(xì)胞在脫落時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡或壞死。在非消化性環(huán)境下腸上皮細(xì)胞只會(huì)在RV感染的末期才出現(xiàn)明顯的脫落，此時(shí)脫落細(xì)胞幾乎全部凋亡及壞死。結(jié)果提示，體內(nèi)RV感染中，被感染的腸上皮細(xì)胞可能還沒(méi)有來(lái)的及凋亡或壞死或其它明顯功能損害就已經(jīng)從基底膜脫

15、落，徹底失去功能。我們進(jìn)一步檢測(cè)了小腸內(nèi)不同段腸腔內(nèi)的胰蛋白酶的活性，結(jié)果顯示在BABL/c小鼠幼仔的空腸中、下段和回腸的上段胰蛋白酶活性最高。此外，通過(guò)結(jié)晶紫對(duì)BABL/c腸上皮細(xì)胞進(jìn)行活體染色發(fā)現(xiàn)，RV感染引起的腸上皮細(xì)胞脫落在上述腸段中最為明顯。我們的結(jié)果提示RV感染導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞在腸道消化性環(huán)境中快速脫落可能才是RV腹瀉產(chǎn)生的根本原因。
　　 其次，為了尋找消化性環(huán)境中RV感染引腸上皮細(xì)胞快速脫落的直接原因，我們采用了一

16、種定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法-細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素氨基酸標(biāo)記(SILAC)來(lái)分析RV感染后Caco-2細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的變化。結(jié)果顯示，RV感染顯著削弱了與細(xì)胞間的粘附相關(guān)蛋白以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，如E-caherin，Plakoglobin，Desmoplakin，層粘連蛋白B2，纖維連接蛋白1，Plectin1，Cingulin以及ZO-1等。Western blot及qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)了這些蛋白質(zhì)在RV感染后顯著

17、下降。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了RV感染引起細(xì)胞間連接包括緊密連接，粘附連接以及橋粒連接的嚴(yán)重?fù)p壞。進(jìn)一步通過(guò)結(jié)晶紫染色發(fā)現(xiàn)，RV感染顯著破壞腸上皮細(xì)胞屏障功能，增大細(xì)胞間隙，導(dǎo)致胰蛋白酶向細(xì)胞底部嚴(yán)重滲漏，從而破壞細(xì)胞.細(xì)胞外基質(zhì)粘附，最終引起上皮細(xì)胞脫落。
　　 最后，為了明確RV感染導(dǎo)致細(xì)胞粘附功能破壞從而引起腸上皮細(xì)胞脫落的的相關(guān)信號(hào)機(jī)制，我們對(duì)RV感染中可能涉及到的激酶和磷酸酶與細(xì)胞脫落之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)抑制

18、酪氨酸蛋白激酶可以顯著抑制消化性環(huán)境中RV感染引起的腸上皮細(xì)胞的脫落，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶則顯著促進(jìn)RV感染及感染的腸上皮細(xì)胞的脫落。抑制蛋白酶磷酸2A(PP2A)同樣顯著促進(jìn)RV感染引起腸上皮細(xì)胞的脫落。此外，免疫印跡法顯示RV感染引起PP2A兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)亞單位PPP2R1A和PPP2R1B表達(dá)減少。RV感染可以引起細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，我們結(jié)果顯示，通過(guò)離子霉素和毒胡蘿卜素增大胞漿Ca2+濃度加速RV感染引起的細(xì)胞脫落。然而，

19、使用BAMPT-AM和U73122抑制胞漿內(nèi)Ca2+增加卻不能阻止消化性環(huán)境中RV感染引起的腸上皮細(xì)胞的快速脫落。這表明RV感染引起胞漿Ca2+的增加只是導(dǎo)致宿主細(xì)胞的脫落促進(jìn)因素而非決定因素。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CYPA是一種新的抗RV感染的宿主限制性因子。CYPA通
　　 過(guò)本身的脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性抑制RV的復(fù)制，其在腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)可能與宿主對(duì)RV的易感性密切相關(guān)。CYPA同時(shí)還可以通過(guò)介導(dǎo)宿主細(xì)胞IF

20、N-I反應(yīng)來(lái)抑制RV感染。CYPA的這種功能不依賴于其脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶活性，而可能依賴于宿主細(xì)胞中JNK信號(hào)通路的激活。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)在消化性環(huán)境中RV感染會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞快速脫落，這種現(xiàn)象可能才是RV腹瀉產(chǎn)生的真正原因。而造成細(xì)胞脫落的原因與RV感染引起腸上皮細(xì)胞粘附功能及屏障功能的破壞，胰蛋白酶滲透到細(xì)胞基底部破壞細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附密切相關(guān)。在這個(gè)過(guò)程中，RV感染引起的酪氨酸蛋白激酶的激活以及PP2A的抑制起到了關(guān)鍵作用，而