肝癌細胞與肝星狀細胞相互作用的實驗研究.pdf

1、研究目的：
　　觀察肝癌細胞與肝星狀細胞相互作用對二者生長狀態(tài)的影響,初步探討肝癌細胞和間質(zhì)細胞的相互作用在肝癌發(fā)展過程中的作用,以期進一步了解肝癌細胞的生物學行為,進而為肝癌治療提供新思路。
　　方法：
　　以人肝癌HepG2細胞系和肝星狀細胞HSC-T6細胞系為研究對象,實驗分為三個部分:1、觀察HepG2細胞條件培養(yǎng)基對HSC增殖活化的影響;2、觀察活化HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞增殖的影響;3、觀察直接共培

2、養(yǎng)的HepG2細胞和HSC超微結(jié)構改變。
　　1、HepG2細胞和HSC-T6細胞的體外培養(yǎng)及傳代
　　采用含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml,10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液,待細胞生長至80%-90%密度時,0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3的比例傳代。
　　2、HepG2和HSC條件培養(yǎng)基的制備
　　HepG2/HSC以3×104/ml的密度接種于含

3、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中(各3瓶),分別收集12h、24h、48h的培養(yǎng)上清,經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾,即獲得HepG2/HSC的12h、24h、48h條件培養(yǎng)基儲存液,–20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　3、觀察HepG2細胞條件培養(yǎng)基對HSC增殖活化的影響
　　1)實驗分為以下幾組:
　?、賹φ战M:普通單獨培養(yǎng)的HSC細胞
　?、趯嶒灲M1:HSC細胞加入12h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2

4、條件培養(yǎng)基
　?、蹖嶒灲M2:HSC細胞加入24h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2條件培養(yǎng)基
　?、軐嶒灲M3:HSC細胞加入48h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HepG2條件培養(yǎng)基
　　2)MTT法檢測不同時間點及不同濃度的HepG2條件培養(yǎng)基對HSC增殖的影響
　　3)流式細胞儀檢測不同濃度48h的HepG2條件培養(yǎng)基對HSC細胞周期的影響
　　4)免疫組化法檢測不同濃度48h的HepG

5、2條件培養(yǎng)基對HSCα-SMA表達的影響
　　4、觀察HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞增殖的影響
　　1)實驗分為以下幾組:
　?、賹φ战M:普通單獨培養(yǎng)的HepG2細胞
　　②實驗組1:HepG2細胞加入12h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
　?、蹖嶒灲M2:HepG2細胞加入24h不同濃度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
　　④實驗組3:HepG2細胞加入48h不同濃

6、度(1∶8、1∶4、1∶2)的HSC條件培養(yǎng)基
　　2)MTT法檢測不同時間點及不同濃度的HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞增殖的影響
　　3)流式細胞儀檢測不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞周期的影響
　　4)免疫組化法檢測不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞PCNA、PPARγ表達的影響
　　5、電鏡觀察直接共培養(yǎng)HepG2和HSC的細胞超微結(jié)構改變
　　結(jié)果：
　　1、H

7、epG2細胞條件培養(yǎng)基對HSC增殖活化影響
　　1)MTT結(jié)果顯示:不同濃度12h、24h、48h的HepG2條件培養(yǎng)基對HSC均有促增殖作用,各濃度實驗組與對照組相比,細胞數(shù)均有顯著增加(P<0.05)。12h、48h的增殖曲線顯示作用強度與條件培養(yǎng)基濃度關聯(lián),呈上升變化。24小時的HSC增殖曲線隨條件培養(yǎng)基濃度的升高有所下降,但細胞增殖仍明顯高于對照組。
　　2)FCM檢測細胞周期結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度48h的HepG2條

8、件培養(yǎng)基處理后,HSC的G0/G1期細胞比例下降,S期細胞比例上升,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。實驗組與對照組相比,增殖指數(shù)PI{(S+G2/M)/( G0/G1+S+G2/M)}升高。
　　3)α-SMA免疫組化結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度48h的HepG2條件培養(yǎng)基作用后,HSC的α-SMA表達增強,且與條件培養(yǎng)基濃度相關。各實驗組與對照組相比有明顯差異(P<0.01)。
　　2、HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞增

9、殖的影響
　　1)MTT結(jié)果顯示:不同濃度、不同時間HSC條件培養(yǎng)基對HepG2細胞均有促增殖作用。各時間點、各濃度實驗組與對照組相比,細胞數(shù)均有顯著增加(P<0.05),增殖曲線顯示作用強度與條件培養(yǎng)基時間和濃度關聯(lián),均呈上升變化。
　　2)FCM檢測細胞周期結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基處理后,HepG2的G0/G1期細胞比例下降,S期細胞比例上升,與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。實驗組與對照組相

10、比,增殖指數(shù)PI升高。
　　3)免疫組學結(jié)果顯示:經(jīng)不同濃度24h的HSC條件培養(yǎng)基處理后,HepG2細胞PCNA的表達增強,PPARγ的表達減弱,兩種蛋白表達的增強與減弱均與條件培養(yǎng)基濃度相關。各實驗組與對照組相比,均有明顯差異(P<0.01)。
　　3、直接共培養(yǎng)HepG2和HSC細胞的超微結(jié)構改變
　　HepG2和HSC直接共培養(yǎng)時,HepG2細胞超微結(jié)構呈現(xiàn)增殖旺盛表現(xiàn),細胞核增大,核不規(guī)則,核仁增大、增多,核