絲裂霉素C與細(xì)胞色素P450的相互作用及對肝原代細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、目的：L絲裂霉素C(刪C)與大鼠肝臟細(xì)胞色素P450的相互作用 2．絲裂霉素C對肝原代細(xì)胞的毒性作用及與細(xì)胞色素P450的相關(guān)性： 在不同條件(有氧、乏氧、Y射線照射和細(xì)胞P450同工酶活性變化)，以及不同作用時間下，研究MMC對兔、人肝原代細(xì)胞毒性的變化，探索MMC細(xì)胞毒性作用的影響因素，及其作用機(jī)制。 方法：L絲裂霉素C(刪C)與大鼠肝臟細(xì)胞色素P450的相互作用 (DINVIVO研究3GyY射線照射

2、和MMC對雄性SD大鼠肝臟細(xì)胞色素P450含量、CYP281和CYP2E1活性的影響： 分別給大鼠腹腔注射lmg／Kgd的MMC(分1d，連續(xù)3d及6d用藥三組)，3mg／Kg的MMC1d，3Gyγ射線全身照射，3GyY射線全身照射加1d3mg／KgMMC，另設(shè)無MMC的空白對照和溶劑對照。各組處理結(jié)束后24h，處死大鼠取肝臟，制備微粒體，測P450含量、CYP281、CYP2E1活性。 (2)麟VIVO研究3種誘導(dǎo)劑對

3、雄性sD大鼠細(xì)胞色素P450含量、CYP281活性的影響，以及SKF525A對不同活性CYP281的抑制作用： 連續(xù)3d給大鼠腹腔注射各種誘導(dǎo)劑[地塞米松(Dexamethasone，DEX)、苯巴比妥鈉(Phenobarbitalsodium，PB)、β-奈黃酮(β-naphthoflavone，p一MF)]，另設(shè)無誘導(dǎo)劑的空白對照和溶劑對照。各組處理結(jié)束后24h，處死大鼠取肝臟，制備肝微粒體，測P450含量和CYP281活性

4、；取各誘導(dǎo)組微粒體，用1．25mmol／LSKF525A處理，測CYP281活性。 (3)EXVIVO研究不同劑量Y射線照射和MMC對雄性SD大鼠肝臟微粒體中CYP281，CYP2E1活性影響： 空白組和經(jīng)苯巴比妥(PB)誘導(dǎo)后大鼠，處理結(jié)束后24h，處死大鼠取肝臟，制備肝微粒體，微粒體分別進(jìn)行2Gy、8Gy、16GyY射線照射；50μmol／L刪C作用：Y射線照射后加MMC作用等處理，然后測定CYP281、CYP2E1

5、活性。 2．絲裂霉素C對肝原代細(xì)胞的毒性作用及與細(xì)胞色素P450的相關(guān)性(D用兔肝原代細(xì)胞研究MMC細(xì)胞毒性作用： 新鮮分離兔肝細(xì)胞，在96孔板上貼壁培養(yǎng)，1d后將培養(yǎng)液換成不同濃度MMC藥液，不同時間(14h、21h、45h、69h)作用及不同劑量(4Gy、8Gy、12Gy)γ射線照射后，用MTT方法測吸光值(∞值)，求得各自的ICso；另將新鮮分離肝細(xì)胞貼壁4d后，用Rifampcin(25μmol／L)、Omepr

6、azole(50μm01／L)誘導(dǎo)2d，然后換不同濃度MMC藥液繼續(xù)培養(yǎng)48h，以不加誘導(dǎo)劑為對照，用MTT方法測吸光值，并求得各自的IC50。對于每塊96孔板，設(shè)不同濃度的Tomaxifen陽性對照，不加藥物的陰性對照，以及不加細(xì)胞的空白對照。 (2)用人肝原代細(xì)胞研究MMC細(xì)胞毒性作用 結(jié)果：L絲裂霉素C(刪C)與大鼠肝臟細(xì)胞色素P450的相互作用 (1)INVIVO研究3GyY射線照射和MMC對雄性SD大鼠

7、肝臟細(xì)胞色素P450含量、CYP281和CYP2E1活性的影響： 給MMClmg／Kgd，1d后大鼠肝臟微粒體的P450含量、CYP281活性變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞O.05)，CYP2E1活性明顯上升(P＜O.01)；連續(xù)3d或6d后，P450含量、CYP281、CYP2E1活性均無明顯變化(P＞O.05)。給3mg/Kg的MMC1d，對P450含量、CYP281活性影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞O.05)，CYP2E1活性上升明顯(P

8、＜O.01)；3GyY射線全身照射后，P450含量、CYP281活性無明顯變化(P＞O.05)，CYP2E1活性下降(P＜O.05)：析因分析發(fā)現(xiàn)3mg／Kg刪C與3Gyy射線之間沒有交互作用。 (2)EXVlVO研究3種誘導(dǎo)劑對雄性SD大鼠細(xì)胞色素P450含量、CYP281活性的影響，以及SKF525A對不同活性CYP281的抑制作用： 陽作用后，大鼠肝臟微粒體P450含量上升(P＜O.05)，CYP281活性明顯增加

9、(P＜O.01)：與空白對照組和溶劑對照組相比，DEX、β-NF作用后，P450含量變化均無統(tǒng)計意義(P＞O.05)，但β-NF使P450含量有上升趨勢；與空白對照組和溶劑對照組相比，DEX作用后，CYP281活性變化無統(tǒng)計意義(P＞O.05)，但有上升趨勢；與空白對照組相比，β-NF組的CYP281活性增加顯著(]KO．05)，但與溶劑對照組相比，無統(tǒng)計意義(P＞O.05)。SKF525A處理不同組別的微粒體后，CYP281活性均下降

10、，其中NS組CYP2B1活性下降43．8％(P＜O.05)，Corn組下降54．0％(P＜O.05)，DEX組下降67．7％(P＜O.01)，PB組下降95．5％(P＜O.05)，β一NF組下降55．6％(P＜O.01)，MMC組下降32．3％(P＜O.05)。 (3)EXVIVO研究不同劑量Y射線照射和MMC對雄性SD大鼠肝臟微粒體中CYP281、CYP2E1活性影響： 大鼠肝臟微粒體中CYP281活性，在各劑量γ射線

11、照射組和50μmol／LMMC作用組的變化沒統(tǒng)計差異(P>O．05)；不同劑量Y射線對CYP2E1活性沒有明顯影響(P>O．05)，但MMC作用使各組CYP2E1活性明顯下降(]KO．01)。兩因素析因分析發(fā)現(xiàn)，對于CYP281、CYP2E1活性，Y射線照射和MMC作用之間沒有交互作用。 2．絲裂霉素C對肝原代細(xì)胞的毒性作用及與細(xì)胞色素P450的相關(guān)性(D用兔肝原代細(xì)胞研究MMC細(xì)胞毒性的作用： 細(xì)胞培養(yǎng)ld后，加MMC

12、，然后進(jìn)行Ogy、4Gy、8Gy、12Gyγ射線照射，21h后測∞值：另外，MMC作用21h后進(jìn)行12GyY射線照射，然后測OD值。IC5。分別為4．57μg／札、4．4lμg／Ml、6．51ug／札、5．12ug／札、4．32ug／Ml，可見各組Icg變化不大，8Gy照射組略有增大。隨著MMC作用時間的延長，Icg逐漸減小，且隨著時間推移，下降的幅度減小，作用14h、21h、45h、69h的IC5,分別為27．80μg／Ml、4．57

13、ug／Ml、0．88μg／Ml、0．34μg／Ml。用Omeprazole誘導(dǎo)2d，CYPlA2活性提高到5．2倍，MMC作用48h，IC60是對照組的63．9％；Rifampcin誘導(dǎo)2d，CYP3A4活性提高到2．3倍，MMC作用48h，Icg是對照組的55．4％，Control、R25、050組Icg分別為7．90μg／Ml、4．38ug／Ml、5．05μg／札，可見各組IC50變化不很明顯。新鮮細(xì)胞培養(yǎng)6d后加MMC作用48h，