LASS2與ATP6L相互作用誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、研究目的:
　　 研究LASS2(homosapienslongevityassurancehomologue2ofyeastLAG1)與質(zhì)子泵的c亞基ATP6L(16kDaproteolipidsubunitofvacuolarH+-ATPase)的相互作用,過表達(dá)LASS2對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)、外H+濃度的影響,以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響及對(duì)凋亡相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　 研究方法:
　　 (1)用真核載體pBiFC

2、-VC155-LASS2和pBiFC-VN155-ATP6L共同轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞,通過雙分子熒光互補(bǔ)分析技術(shù),在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),確定LASS2與ATP6L在細(xì)胞內(nèi)相互作用以及形成異源二聚體的亞細(xì)胞定位。
　　 (2)用pH熒光探針BCECF-AM和BCECF檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、外H+濃度。
　　 (3)采用細(xì)菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建含LASS2基因全長(zhǎng)的重組腺病毒載體,并將其轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞,

3、熒光顯微鏡檢測(cè)重組腺病毒對(duì)肝癌細(xì)胞的感染效率,Westenblot檢測(cè)感染后目的蛋白的表達(dá)。
　　 (4)通過MTT實(shí)驗(yàn)和AnnexinV/PI雙標(biāo)法檢測(cè)LASS2過表達(dá)后對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響。
　　 (5)通過Westernblot方法檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞過表達(dá)LASS2后,Caspase-9、Caspase-3的激活,Bcl-2、Bax、p-ERK的表達(dá)水平變化。
　　 研究結(jié)果:<

4、br>　　 (1)雙分子熒光互補(bǔ)分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)LASS2與ATP6L在細(xì)胞內(nèi)特異性結(jié)合,并且它們形成的蛋白異源二聚體主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。
　　 (2)成功構(gòu)建了重組腺病毒載體Ad-LASS2,并將其感染SMMC-7721細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白GFP的表達(dá),感染效率達(dá)70%以上,Westernblot結(jié)果表明,LASS2能在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。
　　 (3)過表達(dá)LASS2的SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)H+濃度升

5、高,細(xì)胞外H+濃度降低。
　　 (4)MTT和流式結(jié)果表明SMMC-7721細(xì)胞過表達(dá)LASS2后,其生長(zhǎng)能力受到了顯著的抑制,凋亡率增加。
　　 (5)Westernblot結(jié)果表明SMMC-7721細(xì)胞過表達(dá)LASS2后,活性的Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3含量升高,Bax的蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2水平降低,p-ERK水平降低。
　　 結(jié)論：
　　 LASS