多西他賽對(duì)前列腺癌細(xì)胞株C-jun與雄激素受體相互作用的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 前列腺癌(Prostatecarcinoma，PCa)是西方國(guó)家男性最常見的惡性腫瘤，美國(guó)男性因腫瘤導(dǎo)致的死亡率中，前列腺癌排第2位。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的前列腺癌發(fā)病率也在逐年上升，以上海市為例，1973～2000年，上海市男性前列腺癌的發(fā)病率增加了4.8倍，躍居男性泌尿生殖系腫瘤的第1位。目前在我國(guó)前列腺癌已位居泌尿系腫瘤的第二位，僅次于膀胱癌。盡管近年來(lái)前列腺癌的診斷和治療取得了比較大的進(jìn)展，如PSA

2、篩查、前列腺活檢穿刺、根治性前列腺切除、內(nèi)分泌剝奪、放療、化療等綜合診療手段有效的降低了前列腺癌的死亡率。
　　 但由于前列腺癌發(fā)病機(jī)制不清、病情隱匿、臨床癥狀不典型，大約有1/3的病人在診斷時(shí)已經(jīng)存在局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。目前50-70％晚期前列腺癌早期采用的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是雄激素消除治療(Androgenablationtherapy)。
　　 不幸的是，雄激素阻斷僅能暫時(shí)緩解疾病，中位緩解時(shí)間12

3、-20個(gè)月，最終所有病人都將進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌(androgen-independentprostatecancer，AIPC)，雄激素阻斷療法因此失效。如何對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌進(jìn)行進(jìn)一步治療，是臨床上一個(gè)非常棘手的問題。
　　 雄激素依賴型前列腺癌在進(jìn)行雄激素阻斷的內(nèi)分泌治療后，逐漸將轉(zhuǎn)變成雄激素非依賴型前列腺癌，從而導(dǎo)致內(nèi)分泌治療失敗。雖然目前的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能闡明其中的機(jī)理，但許多學(xué)者們都認(rèn)為雄激素受體始終在轉(zhuǎn)

4、變中發(fā)揮著重要的作用。
　　 紫杉醇類藥物被臨床證實(shí)對(duì)前列腺癌有一定的療效，研究表明，紫杉醇化療可以提高雄激素非依賴性前列腺癌的生存率，降低患者血漿前列腺特異抗原(PSA，prostatespecialantibody)水平。多西他賽是紫杉醇類的代表藥物，以多西他賽為中心的化療方案，是晚期前列腺癌的一線化療方案的金標(biāo)準(zhǔn)。
　　 多西他賽的抗癌作用機(jī)理尚未被完全闡明。一般認(rèn)為，多西他賽抗腫瘤的機(jī)理在于其優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的β-

5、微管蛋白，阻礙了GTP及一些輔助蛋白因子與β-微管蛋白的結(jié)合為位點(diǎn)。β-微管蛋白在缺少GTP和輔助因子時(shí)發(fā)生靜態(tài)聚合，破壞了細(xì)胞正常的有絲分裂，使細(xì)胞分裂停滯在G2/M期，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。
　　 但近年來(lái)的一些研究紛紛發(fā)現(xiàn)，多西他賽還在下調(diào)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、有絲分裂和腫瘤發(fā)生中起作用的某些基因，起到抗腫瘤作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，多西他賽可以通過抑制雄激素受體來(lái)發(fā)揮對(duì)前列腺癌的治療作用。這些研究提示我們，對(duì)微管系統(tǒng)的作用及對(duì)G2/M

6、期的阻滯并不是多西他賽誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的唯一機(jī)制，可能有許多信號(hào)傳導(dǎo)通路和機(jī)制參與紫杉醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。其中一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路就是JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)，C-jun-氨基末端激酶(C-jun-N-terminal-kinase，JNK)被激活之后，可以通過激活內(nèi)源性通路，激活BAX(Bcl-2家族的前凋亡蛋白)和Caspase-3（細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶），并磷酸化Bcl-2（抗凋亡蛋白）使其失活，使得促凋亡分子釋放

7、，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 原癌蛋白C-jun已被大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)與許多腫瘤進(jìn)展有關(guān)，其作為JNK的下游分子，可以被JNK磷酸化，其磷酸化位點(diǎn)位于C-jun氨基末端活性區(qū)Set63和Ser73，磷酸化C-jun可以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。C-jun是被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子AP-1的組成部分，被認(rèn)為是AP-1中起主要功能的重要組分。AP-1作為雄激素受體的轉(zhuǎn)錄因子，其活性又與雄激素受體基因調(diào)控能力緊密相關(guān)。在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中，雄激素受體發(fā)揮著至

8、關(guān)重要的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過采用多西他賽處理體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞株，通過westernblotting、DNA轉(zhuǎn)染等方式，試圖了解C-jun與AR在多西他賽作用下的相互作用，為探索多西他賽抗前列腺癌的機(jī)理和尋找前列腺癌多西他賽抵抗現(xiàn)象的原因提供線索。
　　 在之前的研究中，我們通過雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞株LNCaP和雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3在紫杉醇藥物多西他賽處理下雄激素受體和C-jun蛋白表達(dá)等的對(duì)

9、比，發(fā)現(xiàn)這雄激素依賴型和雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞在多西他賽處理下，都表現(xiàn)出C-jun磷酸化增強(qiáng)的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染了雄激素受體后的PC-3細(xì)胞獲得了一定的抵抗多西他賽的能力。但由于兩種細(xì)胞來(lái)源不同（LNCaP細(xì)胞來(lái)源于人前列腺癌淋巴轉(zhuǎn)移灶，PC-3細(xì)胞來(lái)源于人前列腺癌骨轉(zhuǎn)移灶），所表達(dá)的前列腺癌標(biāo)志物也不盡相同，因此用兩者分別模擬雄激素依賴型和雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞，并在多西他賽處理下進(jìn)行比較時(shí)，可比性欠佳。
　　 近年來(lái)國(guó)內(nèi)外均

10、有學(xué)者采用激素遞減法或激素阻斷法培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞，從而獲得穩(wěn)定傳代的非雄激素依賴的LNCaP細(xì)胞亞系，盡管LNCaP細(xì)胞表達(dá)的AR基因并非野生型，但LNCaP與其非雄激素依賴的細(xì)胞亞系仍是較理想的前列腺癌細(xì)胞研究模型。
　　 我們采用多西紫杉醇處理雄激素依賴型LNCaP前列腺癌細(xì)胞及其亞型比卡魯胺抵抗型LNCaP-bic細(xì)胞（非雄激素依賴），采用熒光素酶分析檢測(cè)AR及AP-1基因的表達(dá)，利用Westernblotting，免疫

11、沉淀方法分析C-jun以及AR的蛋白表達(dá)和相互作用。試圖進(jìn)一步分析AR和C-jun之間的相互作用對(duì)前列腺癌多西他賽化療結(jié)果的影響。
　　 二、研究目的
　　 本實(shí)驗(yàn)擬采用多西他賽處理雄激素非依賴型細(xì)胞株P(guān)C-3、雄激素依賴型細(xì)胞株LNCaP及其雄激素非依賴亞型細(xì)胞株LNCaP-bic，探索C-jun與AR在多西他賽處理的前列腺癌細(xì)胞中的相互關(guān)系。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、將PC-3細(xì)胞及LNCaP細(xì)

12、胞，分別分為實(shí)驗(yàn)組（加入2.5nm多西他賽）和對(duì)照組(相應(yīng)濃度的DMSO)，0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后以1.5×105/瓶接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時(shí)后，吸除原培養(yǎng)液，按分組加入相應(yīng)藥物處理，傳代培養(yǎng)30天。用倒置顯微鏡觀察并照相記錄用藥組和對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)變化。Westernblotting方法分析兩組細(xì)胞中p-C-jun的表達(dá)。
　　 2、將PC-3細(xì)胞、LNCaP細(xì)胞消化收

13、集，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃，5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔進(jìn)行換液。吸除原培養(yǎng)液后，分別加入含多西他賽10nmol（對(duì)照組）、10nmol的RPMI培養(yǎng)液180μl，另設(shè)只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞和藥物的為空白組。每組四個(gè)復(fù)孔。將96孔板移入CO2孵箱靜置培養(yǎng)。MTT法測(cè)量細(xì)胞存活率。
　　 4、用脂質(zhì)法將C-jun以及C-jun與AR共轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞株，westernblotting方

14、法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后C-jun和AR的蛋白表達(dá)。設(shè)立空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為對(duì)照組，用多西他賽10nm處理后，MTT法測(cè)量細(xì)胞存活率。
　　 5、Westernblotting分析多西他賽處理的PC-3和LNCaP細(xì)胞在各個(gè)時(shí)刻p-C-jun和p-JNK的表達(dá)。
　　 6、培養(yǎng)傳代LNCaP細(xì)胞非雄激素依賴亞型LNCaP-bic細(xì)胞，用含螢火蟲和海腎熒光酶素的ARE-luc報(bào)告基因質(zhì)粒、AP-1-luc報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24h后，細(xì)

15、胞分為(1)對(duì)照組;(2)DOC組，多西他賽10nm處理48小時(shí);(3)DHT組，雙氫睪酮100nm處理48小時(shí)。裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞提取物用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)（Promega公司），海腎熒光酶素活性作為內(nèi)對(duì)照。分別以ARE和AP-1作為AR和C-jun的指示，熒光素酶方法分析LNCaP細(xì)胞和LNCaP-bic細(xì)胞在多西他賽處理下AR和C-jun基因的表達(dá)。
　　 7、Westernblotting方法檢測(cè)多西他賽處

16、理的LNCaP細(xì)胞和LNCaP-bic細(xì)胞PSA蛋白的表達(dá)情況，免疫沉淀法檢測(cè)二者在多西他賽處理下C-jun以及AR的蛋白表達(dá)和相關(guān)關(guān)系。
　　 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1、PC-3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞10nm多西他賽處理后，C-jun蛋白表達(dá)與未處理組無(wú)明顯差別，但磷酸化C-jun(p-C-jun)蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。
　　 2、在同樣濃度的多西他賽處理下，PC-3細(xì)胞的存活率與LNCaP細(xì)胞相比有顯著性差異(P＜0

17、.05)，轉(zhuǎn)染C-jun基因后的PC-3細(xì)胞提高了對(duì)多西他賽的耐受性，而共轉(zhuǎn)染C-jun/AR基因的PC-3細(xì)胞恢復(fù)了部分對(duì)多西他賽的敏感性。
　　 3、westernblotting分析提示在多西他賽處理的前列腺癌細(xì)胞中，p-JNK蛋白表達(dá)并沒有顯著性變化，體現(xiàn)出和p-C-jun蛋白表達(dá)增強(qiáng)不一致的特點(diǎn)。
　　 4、熒光素酶分析提示在多西他賽處理下，LNCaP細(xì)胞和LNCaP-bic細(xì)胞的AR和C-jun在基因表達(dá)水平

18、上均增強(qiáng)。
　　 5、LNCaP-bic細(xì)胞在多西他賽處理下PSA表達(dá)強(qiáng)于其父代LNCaP細(xì)胞。免疫沉淀提示多西他賽處理后的LNCaP-bic細(xì)胞比起LNCaP細(xì)胞，C-jun與AR有著更強(qiáng)的相關(guān)性。
　　 五、結(jié)論
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中，多西他賽可以采用JNK通路以外的方式磷酸化前列腺癌細(xì)胞中的C-jun，AR和C-jun可以提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐受程度。
　　 多西他賽可以激活A(yù)R非配體依賴的轉(zhuǎn)