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文檔簡介
1、第一部分人TIM-1和TIM-3 Mrna 實(shí)時(shí)SYBR Green I 定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立
目的:建立實(shí)時(shí)SYBR Green I 定量RT-PCR檢測(cè)人TIM-1和TIM-3 Mrna的方法。
方法:從人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取的總RNA中逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增人TIM-1和TIM-3的Cdna,將將純化的人TIM-1和TIM-3的擴(kuò)增產(chǎn)物分別與Pmd18-T Simple 載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α,
2、提取重組質(zhì)粒DNA,PCR鑒定并測(cè)序分析。純化質(zhì)粒并檢測(cè)260 nm 吸光值,確定重組質(zhì)粒原液的拷貝濃度并以此制備熒光定量PCR梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果:建立了TIM-1和TIM-3基因基因Mrna表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,檢測(cè)靈敏度達(dá)103 拷貝,線性范圍為103 ~107 拷貝。閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與PCR體系中起始模板量的對(duì)數(shù)值之間有著良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)分別為1.00和1.00
3、,擴(kuò)增效率分別為1.070和1.023,批內(nèi)及批間變異系數(shù)<5%。熔解曲線分析表明,產(chǎn)物為特異的單峰。
結(jié)論:成功建立檢測(cè)人TIM-1和TIM-3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,為進(jìn)一步研究人TIM-1和TIM-3 功能奠定基礎(chǔ)。
第二部分人T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族及其融合蛋白真表達(dá)載體的構(gòu)建和生物信息學(xué)分析
目的:分別構(gòu)建人T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白基因3成員及其融合蛋白真核表達(dá)載體,并對(duì)TIM基
4、因家族3個(gè)成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
方法:采用Trizol法從人外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總Mrna,利用兩步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增TIM基因家族3個(gè)成員及其胞外(結(jié)構(gòu))域基因片段和人IgG1 Fc基因片段。并將它們分別克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,通過PCR及測(cè)序進(jìn)行鑒定。序列分析后將TIM-3胞外(結(jié)構(gòu))域基因片段亞克隆到已經(jīng)克隆了人IgG1 Fc基因片段真核表達(dá)載體pcDAN3.1(+)上;并通過PCR及雙酶
5、切進(jìn)行鑒定。并應(yīng)用生物信息學(xué)初步分析TIM基因家族的物理化學(xué)性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、功能。
結(jié)果:成功從PBMC中提取并逆轉(zhuǎn)錄的Cdna擴(kuò)增出TIM基因家族3個(gè)成員及其胞外(結(jié)構(gòu))域基因和人IgG1 Fc基因;經(jīng)PCR、酶切鑒定、測(cè)序分析表明它們與GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明TIM-1蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白,有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu),相對(duì)分子量是39.2KD,等電點(diǎn)Pi為6.44。該蛋白含約23.08
6、%的α–螺旋,29.67%的延伸鏈,47.25%的不規(guī)則卷曲,1段20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。TIM-1蛋白亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞膜上。功能分析預(yù)測(cè)TIM-1蛋白具有受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答功能。TIM-3蛋白為穩(wěn)定親水性蛋白,有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu),相對(duì)分子量是33.4KD,等電點(diǎn)Pi為5.54。該蛋白含約32.56%的α–螺旋,8.27%的延伸鏈,49.17%的不規(guī)則卷曲,1段21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。TIM-3蛋白亞細(xì)胞定位
7、于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、液泡、細(xì)胞膜上。功能分析預(yù)測(cè)TIM-3蛋白具有受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TIM-4蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白,有1個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu),相對(duì)分子量是41.6KD,等電點(diǎn)Pi為5.75。該蛋白含約10.32%的α–螺旋,29.89%的延伸鏈,59.79%的不規(guī)則卷曲,1段24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。TIM-4蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、分泌系統(tǒng)的小囊泡、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體上。功能分析預(yù)測(cè)TIM-4蛋白具有受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。<
8、br> 結(jié)論:成功構(gòu)建TIM基因家族成員及其融合蛋白真核表達(dá)載體,并利用生物分析軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。了解TIM基因家族成員的性質(zhì)特征,為進(jìn)一步研究該基因家族奠定基礎(chǔ)。
第三部分人T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白與凋亡細(xì)胞的相互作用研究
目的:為了研究人T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白基因家族與凋亡細(xì)胞之間的相互作用,以進(jìn)一步探討TIM基因家族在細(xì)胞凋亡中作用。
方法:構(gòu)建含人TIM基因三個(gè)成員不同長度
9、片段的9種Pegfp-N1真核表達(dá)載體及其Ig融合蛋白表達(dá)載體。將這些構(gòu)建的真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,并收集上清液。直接采用TIM-EGFP融合蛋白與PI為探針,檢測(cè)TIM蛋白與凋亡細(xì)胞的相互作用。
結(jié)果:人TIM基因家族的3個(gè)蛋白都能直接識(shí)別和結(jié)合凋亡細(xì)胞,而與活細(xì)胞不能結(jié)合。并且,Stim-1-EGFP、Stim-3-EGFP和Stim-4-EGFP融合蛋白與凋亡細(xì)胞之間的相互作用被相應(yīng)的TIM-1-Ig、TIM
10、-3-Ig和 TIM-4-Ig所阻止。而且,結(jié)果表明人TIM基因家族的3個(gè)蛋白通過其IgV區(qū)直接識(shí)別和結(jié)合凋亡細(xì)胞。
結(jié)論:人TIM基因家族的3個(gè)蛋白充當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞的受體,可能在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用。人TIM蛋白可以作為新的蛋白用于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
第四部分人TIM-EGFP 融合蛋白的在大腸桿菌中的表達(dá)和特征的研究
目的:為了探討人TIM-EGFP融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化,并評(píng)價(jià)它們
11、的生物活性。
方法:采用PCR分別擴(kuò)增人TIM基因家族3成員和EGFP片段,并且將它們克隆至原核表達(dá)載體Pet-28a中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒Pet-28a-TIM-EGFP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TIM-EGFP融合蛋白。表達(dá)的融合蛋白經(jīng)Ni-NTA樹脂純化,并且通過熒光顯微鏡檢測(cè)它們與凋亡細(xì)胞的結(jié)合活性。
結(jié)果:分別成功構(gòu)建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-
12、EGFP的融合蛋白表達(dá)載體,并在大腸桿菌中表達(dá)。結(jié)果證明TIM-EGFP融合蛋白3個(gè)成員都能直接識(shí)別和結(jié)合凋亡細(xì)胞,而與活細(xì)胞不能。更進(jìn)一步證實(shí)TIM-4-EGFP與凋亡細(xì)胞的相互作用可以被相應(yīng)的TIM-Ig融合蛋白阻止。
結(jié)論:分別成功構(gòu)建人TIM-1-EGFP、TIM-3-EGFP和TIM-4-EGFP的融合蛋白表達(dá)載體,并在大腸桿菌中表達(dá)。據(jù)所知,這是目前首次在大腸桿菌中表達(dá)TIM基因家族的3個(gè)成員。結(jié)果也表明人TI
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