宿根矮化病菌侵染后甘蔗防御酶活性和蛋白質(zhì)表達(dá)的變化.pdf

1、甘蔗是熱帶和亞熱帶作物,又是典型的C4作物,其進(jìn)行光合作用的能力遠(yuǎn)高于其它作物,也是我國最重要的糖料作物和最具有潛力的能源作物。甘蔗宿根矮化病(RSD)是一種由細(xì)菌引起的種苗傳播病害,是甘蔗生產(chǎn)中最為嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一,由于感染RSD的蔗株一般不表現(xiàn)典型的外部癥狀,極易造成病原菌的高度累積和大面積蔓延,造成甘蔗產(chǎn)量和糖分的損失,對宿根蔗的影響尤其嚴(yán)重。由于RSD病原菌體外很難分離培養(yǎng),關(guān)于RSD病原菌致病性以及與甘蔗互作的研究受到一定程

2、度的限制。本研究從感病的甘蔗體內(nèi)分離、培養(yǎng)、純化得到RSD病原菌,以此為抗原,制備RSD的多克隆抗體;并利用分離培養(yǎng)的RSD病原菌接種甘蔗,比較感染RSD病菌與健康甘蔗之間的防御酶活性變化,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法比較其蛋白質(zhì)的差異表達(dá),尋找與RSD病菌脅迫相關(guān)的基因,利用同源克隆等技術(shù)對這些基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,結(jié)果表明:
　　1、以PCR檢測有陽性條帶的甘蔗為材料,采用改良的SC培養(yǎng)基成功培養(yǎng)出RSD的病原菌Lxx,并分別從形態(tài)學(xué)

3、、PCR檢測、rDNA-ITS序列的比對多方面進(jìn)行證實(shí),確定此次培養(yǎng)的菌落即為RSD的致病菌Lxx,以此進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),并與福氏完全佐劑混合乳化,皮下多點(diǎn)注射免疫兔子,制備RSD多克隆抗體。用間接ELISA法檢測RSD多克隆抗體的效價(jià),結(jié)果表明本研究所制備的RSD多克隆抗體的效價(jià)大于1:256000。用組織印記免疫(TBIA)的方法檢測自制的RSD多克隆抗體并比較從美國引進(jìn)的RSD多克隆抗體,結(jié)果兩種不同來源的抗體檢測蔗莖感染RSD的結(jié)果

4、一致,說明RSD多克隆抗體已被成功制備。
　　2、以接RSD病菌的甘蔗及健康甘蔗(GT11)為材料,研究RSD病原菌脅迫下甘蔗相關(guān)防御酶活性變化。結(jié)果表明在RSD病菌脅迫下,莖與葉中CAT、SOD、POD、APX及GR活性均有所提高,但不同防御酶在同一器官及相同的防御酶在不同器官表現(xiàn)均有所不同,在莖中除APX活性一直高于對照外,其它酶活性都表現(xiàn)為在90天時(shí)低于對照,180天時(shí)都高于對照;在葉中則與此相反,除POD活性一直高于對照外

5、,其它則是在90天時(shí)高于對照,180天時(shí)都低于對照。這可能是由于RSD病原菌在莖與葉中侵入的時(shí)期不同,還有大量定殖時(shí)期不同而引起的。
　　3、利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)分析蔗莖在RSD病原菌脅迫下的蛋白質(zhì)表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)40個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中有16個(gè)蛋白點(diǎn)表現(xiàn)上調(diào),24個(gè)蛋白點(diǎn)表現(xiàn)下調(diào),應(yīng)用MALDI-TOF-TOF/MS串聯(lián)質(zhì)譜成功鑒定出23個(gè)蛋白質(zhì)。根據(jù)功能將其分為6類,其中參與防衛(wèi)反應(yīng)的占31％、細(xì)胞生長和分裂占9%、蛋白修飾與加

6、工占18%、基礎(chǔ)代謝占23%、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)5%、未知功能的占14%,可見甘蔗對RSD病原菌脅迫的應(yīng)答機(jī)制是一個(gè)涉及多系統(tǒng)、多水平的綜合過程。
　　4、采用同源克隆的方法克隆得到了4個(gè)與RSD病菌侵染相關(guān)的cDNA全長:甘蔗類異黃酮還原酶基因(SoIRL)、NADP-異檸檬酸脫氫酶基因(SoNADP-IDH)、乙醇脫氫酶基因(SoADH)及咖啡酸3-O-轉(zhuǎn)移酶基因(SoCOMT);構(gòu)建了這4個(gè)基因的原核表達(dá)載體,并成功導(dǎo)入大腸桿菌,獲得