甘蔗宿根矮化病病原菌Lxx18460基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、本研究克隆了甘蔗宿根矮化病病原菌中推測為抗οK因子(anti-sigma K factor，RskA)的膜蛋白(membrane protein，MP)Lxx18460基因，分析其基因結(jié)構(gòu)和在感病甘蔗體內(nèi)的表達(dá)情況，構(gòu)建了Lxx18460基因全長和去跨膜區(qū)域的Lxx18460基因可讀框349-717序列的原核表達(dá)載體，讓其在大腸桿菌中表達(dá)，純化并鑒定表達(dá)產(chǎn)物，為進(jìn)一步了解甘蔗宿根矮化病病原菌Lxx18460抗σK蛋白的表達(dá)調(diào)控提供理論基

2、礎(chǔ)和技術(shù)支持。主要結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)GenBank上的甘蔗宿根矮化病病原菌的Lxx18460的基因序列(NC＿006087)，設(shè)計(jì)特異性引物，以Lxx基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到Lxx18460基因全長(720 bp)、含酶切位點(diǎn)但不含終止密碼子的Lxx18460基因(736 bp)和去跨膜區(qū)域的Lxx18460基因可讀框349-717序列(385 bp)。序列分析表明：擴(kuò)增到的Lxx18460基因全長與NC006

3、087的核苷酸序列同源性100％，含酶切位點(diǎn)但不含終止密碼子的兩個(gè)目的DNA序列正確。生物信息學(xué)分析得知，Lxx18460蛋白相對分子量約為24.8 kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.01，為可溶性穩(wěn)定蛋白；有一個(gè)跨膜區(qū)域，具體位于92-114位之間；含有一個(gè)典型的保守結(jié)構(gòu)，位于第43-238位之間，為蛋白質(zhì)家族RskA；氨基酸同源性分析表明，Lxx18460蛋白與其它菌種的RskA基因同源性低。
　　 2.從感染RSD的甘蔗品種GT

4、11葉片的cDNA中，根據(jù)Lxx18460基因的首尾設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增到為一條720 bp的條帶，GenBank基因登錄號為JQ740153。克隆測序顯示，其與GenBank公布的Lxx的核苷酸序列(NC006087)和氨基酸序列同源性均為100％。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對Lxx18460基因在感染RSD甘蔗品種GT11成熟期莖和葉中的表達(dá)研究表明：莖、葉中均有Lxx18460基因的表達(dá)，在莖的基部第一節(jié)中其相對表達(dá)量最高，之后往

5、尾梢方向相對表達(dá)量逐漸減少，葉中相對表達(dá)量明顯比莖低，莖尖和+1葉中相對表達(dá)量最少。
　　 3.本研究成功構(gòu)建了Lxx18460基因全長以及其基因可讀框349-717序列的原核表達(dá)載體pET30a-MP和pET30a-MPDo在28℃和37℃條件下，3個(gè)不同濃度的IPTG均不能誘導(dǎo)pET30a-MP融合蛋白的表達(dá)；37℃條件下，3個(gè)不同IPTG濃度也不能誘導(dǎo)pET30a-MPD融合蛋白的表達(dá)；而在28℃條件下，在3個(gè)不同濃度和不