‘黃花水仙2號(hào)’三個(gè)WD40相關(guān)基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、中國(guó)水仙為三倍體，長(zhǎng)期以鱗莖無(wú)性繁殖，其栽培品種退化趨勢(shì)明顯，抗逆性減弱。而隨著城市化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，可以用于栽種水仙的良田大幅減少。因此，提高中國(guó)水仙的抗性，使其能夠適應(yīng)較為復(fù)雜的栽培環(huán)境，對(duì)中國(guó)水仙未來(lái)的持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。本研究從福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院水仙課題組已獲得的多花水仙花瓣抑制消減雜交 cDNA文庫(kù)中篩選得到‘黃花水仙2號(hào)’的3個(gè)的編碼WD40蛋白的基因片段NtWD1、NtWD2、NtWD3，通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)克隆

2、其cDNA全長(zhǎng)。同時(shí)利用熒光定量PCR對(duì)上述三者和一個(gè)已知基因NtWD40進(jìn)了不同組織部位中及七種非生物逆境下的表達(dá)分析，為中國(guó)水仙的種質(zhì)改良和抗逆品種的選育提供參考。
　　黃花水仙2號(hào)NtWD1、NtWD2、NtWD3基因的克隆通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)從黃花水仙2號(hào)的花瓣中克隆得到了NtWD1基因cDNA全長(zhǎng)及NtWD2、NtWD3基因的5’端部分。NtWD1基因包含一個(gè)3372bp的開(kāi)放閱讀框，共編碼1126個(gè)氨基酸。N

3、端含有一個(gè)LisH（lissencephaly homology）和一個(gè)CLTH（C-terminal to LisH）結(jié)構(gòu)域，中部和C端共有11個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域。其二級(jí)結(jié)構(gòu)具有TPL/TPR（TOPLESS/TOPLESS-RELATED）類(lèi)共抑制因子的特征。三維構(gòu)象模擬顯示其有兩個(gè)呈一定角度的七葉β-螺旋槳結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示它和海棗、油棕、小果野蕉的親緣關(guān)系較近。通過(guò)5’RACE得到NtWD2、NtWD3基因5’端部分，與已知

4、片段拼接后得到了長(zhǎng)為741bp的NtWD2基因片段和長(zhǎng)為1639bp的NtWD3基因片段。
　　黃花水仙2號(hào)NtWD1、NtWD2、NtWD3、NtWD40基因的表達(dá)分析根據(jù)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析，NtWD1基因編碼的蛋白與TPL/TPR類(lèi)共抑制因子相似度高，而NtWD2、NtWD3和NtWD40基因編碼未注釋功能的蛋白。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)上述4個(gè)基因進(jìn)行了組

5、織特異性和七種非生物逆境（干旱、高溫、機(jī)械損傷、MeJA、ABA、2,4-D、高鹽）下的表達(dá)分析。結(jié)果表明，NtWD40在根中幾乎不表達(dá)，NtWD3在根、葉、花瓣、副冠中的表達(dá)量基本一致。NtWD1、NtWD2在副冠中的表達(dá)量都略高于花瓣。NtWD1基因在MeJA、ABA、2,4-D、高鹽、機(jī)械損傷等5組處理中基因表達(dá)量都出現(xiàn)了十分顯著的上調(diào)，說(shuō)明這個(gè)基因參與到了上述逆境響應(yīng)中。NtWD2在鹽脅迫處理中表達(dá)量變化最為顯著。NtWD3在A