基于小麥灌漿期熱脅迫轉錄組分析及三個耐熱相關基因的克隆、表達特征分析和遺傳轉化.pdf

1、本文基于小麥品種“中國春”“Triticum aestivumlL. Chinese Spring”灌漿期熱脅迫下旗葉組織轉錄組分析，篩選得到2429個熱脅迫應答候選基因，同時根據轉錄組分析結果，選定了2個受高溫強烈誘導表達的基因TaG1和TaG12，以及1個受高溫抑制表達的基因TaG16進行了深入研究，并通過RT-PCR技術克隆得到這3個基因的基因組序列和cDNA序列，并通過同源性氨基酸序列分析、組織表達和高溫脅迫應答分析、植物表達載

2、體構建和遺傳轉化等方法，以期從上述基因的角度探索高溫脅迫下小麥的應答機制，并獲得熱脅迫相關優(yōu)異基因資源，為小麥品種耐熱性狀改良提供指導和奠定基礎。具體研究結果如下：
　　1.通過對小麥品種“中國春”灌漿期高溫（38℃）8 h處理和適溫（24℃）對照下旗葉組織樣品轉錄組測序分析結果顯示，對照及處理組有效序列標簽（Clean tags）數目分別占總序列的百分比分別為96.74％和96.63%，并且對照和處理樣品所檢測到的基因數目已基本

3、飽和，完全符合轉錄組測序分析需求；隨后在完成樣品轉錄組深度測序之后，對高溫脅迫下小麥葉片組織中基因的高溫應答情況進行分析結果顯示，在檢測到的93003個基因中有1058個基因屬于熱脅迫誘導上調類型，1371個基因轉錄表達受高溫脅迫抑制。獲得2429個熱脅迫應答候選基因，為研究小麥耐熱性機制獲得了大量的優(yōu)異基因資源。
　　2.根據轉錄組分析結果，初步選定了2個受高溫誘導強烈表達的基因TaG1和TaG12，以及1個受高溫抑制表達的基因

4、TaG16進行了深入研究。核酸序列及氨基酸序列分析表明，小麥TaG1基因cDNA序列全長546 bp、基因組全長1071 bp、開放讀碼框420 bp、含有4個內含子、編碼139個氨基酸、氨基酸序列與節(jié)節(jié)草、短柄草、水稻來源的PSII10kD葉綠體蛋白氨基酸序列相似性分別為100%、89%和83%，說明小麥TaG1基因表達蛋白屬于植物PSII10kD葉綠體蛋白家族；小麥TaG12基因cDNA序列全長1297bp、基因組全長1297 bp

5、、開放讀碼框972 bp、無內含子、編碼323個氨基酸、氨基酸序列與水稻、山羊草來源的未知蛋白氨基酸相似性分別為66%和60%，小麥TaG12基因表達蛋白功能還未發(fā)現；小麥TaG16基因cDNA序列全長1220 bp、基因組全長1756 bp、開放讀碼框1083 bp、含有1個內含子、編碼360個氨基酸、氨基酸序列與黑麥草、山羊草來源的咖啡酸-O-甲基轉移酶蛋白相似性分別為83%和99%，說明小麥TaG16基因表達蛋白屬于植物咖啡酸-O

6、-甲基轉移酶蛋白家族。組織表達分析表明，TaG1基因在“中國春”各組織的表達量強弱順序分別為葉片、穎殼、莖、根和籽粒；TaG12基因的表達量強弱順序為葉片、莖、籽粒、穎殼和根；TaG16基因的表達量強弱順序為根、莖、穎殼、葉片和籽粒，顯示出較強的組織特異性。高溫脅迫應答分析表明，小麥TaG1和TaG12基因高溫脅迫下轉錄本呈現上調表達模式，而TaG16基因的表達受高溫抑制。
　　3.為深入研究這3個耐熱候選基因的功能，通過構建植物

7、表達載體并通過農桿菌介導擬南芥轉基因技術遺傳轉化和種子萌發(fā)期熱脅迫表型鑒定。結果表明，成功構建了3個超量植物表達載體pCAMBIA3301::TaG1、pCAMBIA3301::TaG12和pCAMBIA3301::TaG16。采用農桿菌介導法將上述基因導入野生型擬南芥品種“Col-o”，經特異性PCR鑒定及測序證實，外源目的基因已整合進入受體擬南芥基因組，并且分別獲得轉TaG1基因植株15株、轉TaG12基因植株20株和轉TaG16基

8、因植株23株。種子萌發(fā)期高溫（45℃）脅迫下萌發(fā)率分析表明，3個轉TaG1基因擬南芥株系TaG1-1，TaG1-4和TaG1-7種子的萌發(fā)率與野生型“Col-o”萌發(fā)率間無顯著性差異（P>0.05）；轉TaG12基因的3個株系TaG12-2，TaG12-4和 TaG12-6擬南芥種子萌發(fā)率與野生型“Col-o”萌發(fā)率間差異顯著（P<0.05）；轉 TaG16基因3個株系TaG16-1，TaG16-3和TaG16-5擬南芥種子萌發(fā)率與野生