豬水腫病菌毒素A亞單位（SLT-ⅡeA）單抗的制備及SLT-ⅡeA與F18ab菌毛A亞單位的聯(lián)合表達(dá).pdf

1、該研究制備獲得了針對SLT-ⅡeA亞單位的單克隆抗體,利用實驗室現(xiàn)有的SLT-ⅡeA亞單位重組表達(dá)菌pSLT-ⅡeA在2×YTA培養(yǎng)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-SLT-ⅡeA,經(jīng)谷胱苷肽活化的Sepharose 4B親和層析柱提純后測定濃度,作為免疫原免疫BALB/c小鼠.經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的重組菌、未經(jīng)誘導(dǎo)不表達(dá)融合蛋白的重組菌及僅表達(dá)載體蛋白GST的重組菌三者的裂解產(chǎn)物包被ELISA板,細(xì)胞融合后培養(yǎng)基上清經(jīng)檢測獲得1株針

2、對SLT-Ⅱe A亞單位的雜交瘤細(xì)胞,命名為A<,2>-D<,3>,制備的單抗腹水ELISA效價為24log2,免疫印跡結(jié)果表明此單抗僅與融合蛋白反應(yīng),而與載體蛋白不反應(yīng).利用此單抗經(jīng)Western-blotting檢測13個水腫病菌株,發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生志賀樣毒素Ⅱ型變異體.用PCR技術(shù)對F107/86標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增F18ab菌毛主要亞單位A(FedA)的510bp的基因序列(fedA),并將PCR擴(kuò)增片段在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點克隆進(jìn)p

3、GEX-6P-1質(zhì)粒載體,獲得重組質(zhì)粒pE107,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST-F107.利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點將SLT-ⅡeA基因序列從已有的重組表達(dá)質(zhì)粒pSLT-ⅡeA中切出亞克隆入pF107下游,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pFSLT-ⅡeA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),通過對重組大腸桿菌pFSLT-ⅡeA的菌體裂解物的SDS-PAGE電泳分析及Western-blotting鑒定,表明重組