亞低溫對顱腦創(chuàng)傷后鈉通道α亞單位表達(dá)的影響.pdf

1、顱腦創(chuàng)傷(TBI)死殘率高，其繼發(fā)性腦損傷可導(dǎo)致大量神經(jīng)元死亡或凋亡，是致死、致殘的重要病理基礎(chǔ)，TBI所誘導(dǎo)的興奮性毒性作用被公認(rèn)為繼發(fā)性腦損傷的最重要病生機(jī)制之一，其中電壓門控的鈉離子通道(VGSC)的作用至關(guān)重要，TBI后早期VGSC功能異常導(dǎo)致Na+過度內(nèi)流造成細(xì)胞內(nèi)Na+濃度([Na+]i)急遽升高被認(rèn)為是繼發(fā)性腦損傷的始動因素之一。亞低溫對TBI和腦缺血具有腦保護(hù)作用已經(jīng)被許多實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，然而其確切的機(jī)制尚有待闡明，

2、亞低溫對TBI和腦缺血誘導(dǎo)的興奮性氨基酸過量釋放的抑制作用據(jù)認(rèn)為是其主要的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一，本課題主要研究了TBI后VGSCα亞單位家族中主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的成員Nav1.1、Na1.2、Nav1.3和Nav1.6的mRNA和蛋白在大鼠海馬中的表達(dá)情況，以及亞低溫對這些VGSC在TBI后表達(dá)的影響，試圖從mRNA和蛋白水平了解TBI對VGSC的影響，從VGSC的角度探索亞低溫在TBI后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。 本研究共分三個部份，

3、一、常溫及亞低溫大鼠液壓顱腦傷模型的建立；二、顱腦創(chuàng)傷后Na1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6在大鼠海馬的異常表達(dá)；三、亞低溫對TBI后大鼠海馬的VGSCα亞單位表達(dá)的影響。 第一部份常溫及亞低溫大鼠液壓顱腦傷模型的建立 目的：建立穩(wěn)定的常溫和亞低溫大鼠TBI模型，從神經(jīng)行為學(xué)和組織病理學(xué)角度評判模型質(zhì)量，為之后的進(jìn)一步研究建立起可靠的實(shí)驗(yàn)平臺。 方法：將成年雄性SD大鼠75只(剔除外傷直接致死者)

4、隨機(jī)分為亞低溫組(n=25)、常溫組(n=25)和假損傷組(n=25)，亞低溫組大鼠TBI形成后立即予以冰浴降溫，使腦溫在15分鐘內(nèi)下降至32±2℃，并維持該腦溫水平4 h，之后在1h內(nèi)復(fù)溫至正常水平，常溫組大鼠只致傷不降溫，保持腦溫在37±0.8℃，假損傷組大鼠僅做致傷前準(zhǔn)備而不予以液壓打擊。每組各15只在完成行走試驗(yàn)訓(xùn)練后行液壓顱腦傷，傷后連續(xù)5天行行走試驗(yàn)，比較分析各組大鼠的逃脫時間，另取每組大鼠各6只于傷后12 h行雙側(cè)大腦半球

5、水含量分析，每組各4只于傷后72 h行組織病理學(xué)分析(H&E染色和Fluoro-Jade染色)。 結(jié)果：常溫組和亞低溫組大鼠TBI后行走試驗(yàn)的逃脫時間較致傷前及假損傷組大鼠顯著延長(p<0.01)，亞低溫組大鼠逃脫時間較常溫組大鼠有明顯縮短(p<0.01)，而且傷后第五天時亞低溫組大鼠逃脫時間的改善程度也明顯優(yōu)于常溫組(p<0.01)。雙側(cè)大腦半球水含量檢測顯示亞低溫組大鼠雙側(cè)大腦半球含水量均明顯低于常溫組大鼠(p<0.01)。

6、組織病理學(xué)分析顯示亞低溫組大鼠致傷灶周圍皮層和海馬CA1及CA3區(qū)腦損傷程度較常溫組大鼠明顯減輕。 結(jié)論：該實(shí)驗(yàn)成功建立了神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)和組織病理學(xué)檢測均接近TBI臨床的中度TBI動物模型，TBI后早期實(shí)施亞低溫干預(yù)可提供有效的神經(jīng)保護(hù)作用。 第二部份顱腦創(chuàng)傷后Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6在大鼠海 目的：研究TBI對主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的VGSCα亞單位異構(gòu)體的mRNA和蛋白

7、表達(dá)的影響。 方法：將48只(剔除外傷直接致死者)成年SD大鼠隨機(jī)分為對照組和TBI組(每個時間節(jié)點(diǎn)n=6)，TBI組行傷前準(zhǔn)備手術(shù)后接受液壓打擊，對照組大鼠只做傷前準(zhǔn)備手術(shù)而不接受液壓打擊。實(shí)施腦液壓傷后分別在傷后2、12、24和72 h處死，取傷側(cè)海馬行熒光定量PCR和Western blot以及免疫熒光染色等方法檢測Nav1.1、Nav1.2、N2v1.3和Nav1.6的mRNA和蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：大鼠腦液壓傷

8、后，Nav1.1和Nav1.2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(p<0.01)，并在傷后2 h下調(diào)至最低水平，Nav1.3和Nav1.6的mRNA表達(dá)則顯著上調(diào)(p<0.01)，傷后12 h上調(diào)至最高水平。TBI后早期，Nav1.1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(p<0.01)，Nav1.2的蛋白表達(dá)水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，Nav1.3和Nav1.6的蛋白表達(dá)水平則顯著上調(diào)(p<0.01)。 結(jié)論：TBI導(dǎo)致了大鼠海馬鈉通道

9、a亞單位mRNA和蛋白表達(dá)的顯著改變，不同的異構(gòu)體改變方式不同，這可能是TBI后神經(jīng)元細(xì)胞膜上的鈉通道過度激活及其誘發(fā)的興奮性毒性作用的分子學(xué)基礎(chǔ)之一。 第三部份亞低溫對TBI后大鼠海馬的VGSCα亞單位表達(dá)的影響 目的：研究亞低溫對TBI所致的大鼠海馬VGSCα亞單位異常表達(dá)的作用。 方法：將54只(外傷直接致死者已剔除)成年雄性SD大鼠(280～330 g)隨機(jī)分為亞低溫組、常溫組和對照組，亞低溫組大鼠TBI

10、形成后立即接受冰浴處理使腦溫于15分鐘內(nèi)降至32±2℃，并維持4h，之后在1h內(nèi)復(fù)溫至37±0.8℃，常溫組大鼠TBI形成后維持正常體溫。兩組大鼠(每個時間節(jié)點(diǎn)n=6)分別于傷后6、12、24和72 h處死，取傷側(cè)海馬行熒光定量PCR和Western blot以及免疫熒光染色等方法檢測Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3和Nav1.6的mRNA和蛋白表達(dá)情況，對照組不接受任何處理直接進(jìn)行熒光定量PCR和Western blot以及免

11、疫熒光實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果：亞低溫組大鼠TBI后的Na1.1和Na1.2 mRNA表達(dá)下調(diào)幅度和Nav1.3與Nav1.6的mRNA表達(dá)上調(diào)幅度明顯小于常溫組大鼠，Nav1.1蛋白水平的下調(diào)程度以及Nav1.3和Nav1.6蛋白的上調(diào)程度也明顯小于常溫組大鼠，但亞低溫對Nav1.2蛋白的表達(dá)沒有明顯的影響。 結(jié)論：TBI后早期實(shí)施亞低溫干預(yù)能在一定程度上糾正TBI導(dǎo)致的VGSCα亞單位的mRNA和蛋白表達(dá)異常，可能與其在TBI后

12、通過抑制興奮性氨基酸的過度釋放達(dá)到腦保護(hù)作用的機(jī)制有關(guān)。 本研究結(jié)果表明TBI可通過一定的機(jī)制影響VGSCα亞單位在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，這些VGSCα亞單位在TBI后出現(xiàn)的表達(dá)異常均能為亞低溫所糾正。這些發(fā)現(xiàn)說明：一、TBI可迅速導(dǎo)致VGSC的表達(dá)出現(xiàn)顯著改變，提示VGSC對TBI的反應(yīng)是在mRNA和蛋白水平上就發(fā)生了的；二、不同的α亞單位在TBI后的表達(dá)變化方向不同，這意味著不同的VGSCα亞單位針對TBI的反應(yīng)機(jī)制各異，它

13、們在TBI后的繼發(fā)性腦損傷過程中可能起著不同的作用；三、這些TBI后的表達(dá)異常在經(jīng)過亞低溫處理后發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，這一方面證明了這些VGSCα亞單位與TBI關(guān)系密切，另一方面也顯示亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制很可能還涉及鈉通道m(xù)RNA和蛋白表達(dá)的調(diào)整。 綜上所述，本研究證明TBI可早期導(dǎo)致VGSCα亞單位的表達(dá)異常，并能為亞低溫處理所逆轉(zhuǎn)，目前國內(nèi)外尚無相同報道，如能深入研究TBI后VGSCα亞單位表達(dá)異常的病理生理意義，則有望找到TBI后神經(jīng)