亞低溫聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)顱腦創(chuàng)傷后β-淀粉樣蛋白(Aβ)表達(dá)影響的體內(nèi)體外研究.pdf

1、目的：擬通過(guò)檢測(cè)β-淀粉樣蛋白(Aβ)在臨床顱腦創(chuàng)傷(TBI)患者體液中表達(dá)量的改變，證實(shí)其參與TRI的進(jìn)展；構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SH-SY5Y-APP細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Aβ的細(xì)胞模型，采用亞低溫干預(yù)手段，證實(shí)該措施對(duì)細(xì)胞創(chuàng)傷起一定程度的保護(hù)作用；在此基礎(chǔ)上回歸體內(nèi)試驗(yàn)，常規(guī)建立液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型，除給予亞低溫保護(hù)性干預(yù)外，應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素(EPO)及其與亞低溫聯(lián)合干預(yù)，觀察治療效果，尋找顱腦創(chuàng)傷的新的

2、治療靶點(diǎn)，為臨床早期干預(yù)尋找新的方向。
　　方法：本課題分為三部份，第一部分：通過(guò)對(duì)60例小樣本的臨床病例進(jìn)行檢測(cè)，分別于患者入院后第0h、24h、48h、72h留取CSF、外周血，ELISA方法檢測(cè)Aβ含量，并采用GCS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)判斷預(yù)后評(píng)估，檢測(cè)Aβ在腦脊液及血清中的變化與預(yù)后的相關(guān)性。第二部分：構(gòu)建pIRES2-EGFP-APP重組表達(dá)載體，常規(guī)培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞系，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，western-blot方法檢測(cè)

3、細(xì)胞蛋白中APP是否表達(dá)及表達(dá)量高低，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)APP的細(xì)胞模型；并在此基礎(chǔ)上給予常溫及亞低溫培養(yǎng)，檢測(cè)不同溫度條件下細(xì)胞生長(zhǎng)情況。第三部分：制備液壓顱顱腦創(chuàng)傷模型，大鼠造模結(jié)束后采用冰袋包裹頭部以下部位，30分鐘內(nèi)將體溫降至31℃保持溫度波動(dòng)于31-33℃，5小時(shí)；其后將體溫升至37.5-38.5℃。rhEPO組大鼠致傷后即刻及每天腹腔內(nèi)注射(5000IU/kg)rhEPO，術(shù)后每12h肌注青霉素鈉40萬(wàn)U。分別于手術(shù)后0.5h、2

4、h、6h、12h、24h、48h、72h，ELISA方法檢測(cè)血清及腦脊液中Aβ含量，病理檢查觀察TBI模型腦組織創(chuàng)傷情況，western-blot檢測(cè)不同干預(yù)方式腦組織中Aβ表達(dá)。
　　結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小樣本的臨床病例的體液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顱腦創(chuàng)傷患者術(shù)后Aβ隨時(shí)間改變逐步升高，其機(jī)制涉及顱顱腦創(chuàng)傷可致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞創(chuàng)傷，血腦屏障破壞，進(jìn)而使得崩解的細(xì)胞骨架中的AB進(jìn)入腦脊液及血液循環(huán)，其表達(dá)水平與創(chuàng)傷程度呈正相關(guān)。第

5、二部分的研究結(jié)合臨床檢驗(yàn)的結(jié)果，選用真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP來(lái)轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞系，基于細(xì)胞標(biāo)記示蹤理論依據(jù)，并借助該實(shí)驗(yàn)手段對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行反復(fù)篩選，從而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并大量表達(dá)APP的細(xì)胞系。通過(guò)Western-blot進(jìn)一步證明了APP基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。并給予細(xì)胞株常溫培養(yǎng)及亞低溫培養(yǎng)兩種不同的干預(yù)措施，證實(shí)亞低溫對(duì)細(xì)胞創(chuàng)傷起一定程度的保護(hù)作用。第三部分進(jìn)行了體內(nèi)模型的構(gòu)建和研究，成功構(gòu)建了大鼠液壓沖擊顱顱腦創(chuàng)傷

6、模型，通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分鑒定了模型的可行性，在此基礎(chǔ)上分別給予亞低溫、EPO、及兩者聯(lián)合干預(yù)治療的方式，證實(shí)亞低溫聯(lián)合EPO可有效保護(hù)顱腦創(chuàng)傷后大腦功能的改變，為進(jìn)一步深入展開(kāi)創(chuàng)傷性顱腦的治療提供新的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)。
　　結(jié)論：在常規(guī)治療的同時(shí)，采用亞低溫治療可抑制重型顱顱腦創(chuàng)傷患者的Aβ的表達(dá)及ICP水平并提高患者預(yù)后，Aβ作為一種新生物標(biāo)記物，其動(dòng)態(tài)變化與顱顱腦創(chuàng)傷創(chuàng)傷程度有一定相關(guān)性，Aβ含量變化作為患者預(yù)后一項(xiàng)評(píng)定指標(biāo)。