顱腦創(chuàng)傷后亞低溫腦保護(hù)的機(jī)制：鈣蛋白酶Calpain及相關(guān)底物MAP-2的研究.pdf

1、大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)均證實(shí)亞低溫治療能減輕顱腦創(chuàng)傷后病理?yè)p害的程度，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，但其保護(hù)作用的機(jī)制仍未完全明了。其中尚有許多未能徹底闡明或印證的環(huán)節(jié)以及相互作用關(guān)系，而且在亞低溫治療的方法學(xué)上也存在著許多熱點(diǎn)問(wèn)題，一直也是科學(xué)界研究的重點(diǎn)。其機(jī)制研究也由生化、代謝水平深入至分子水平，人們開(kāi)始從分子水平闡述亞低溫腦保護(hù)的作用機(jī)制。 Calpain是中樞神經(jīng)半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，通常以沒(méi)有活性的酶前體形式存在于神經(jīng)元

2、內(nèi)，胞內(nèi)Ca2+超過(guò)一定閾值時(shí)可激活此酶。Calpain持續(xù)激活導(dǎo)致蛋白和酶的大量水解。主要集中于它對(duì)細(xì)胞骨架蛋白，即血影蛋白(Spectrin)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)和神經(jīng)絲(Neurofilament)的水解破壞從而參與繼發(fā)性腦損傷。目前，在顱腦外傷模型中，尚無(wú)報(bào)道亞低溫腦保護(hù)治療對(duì)Calpain及其作用底物MAP-2的基因或蛋白表達(dá)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)將研究顱腦外傷后動(dòng)物腦組織Calpain及其作用底物MAP-2的基因和

3、蛋白的改變，以及亞低溫腦治療對(duì)其產(chǎn)生的影響。 本實(shí)驗(yàn)分為三部分：第一部分：大鼠液壓沖擊腦損傷后亞低溫和常溫模型的建立；第二部分：顱腦外傷后亞低溫治療對(duì)Calpain基因和蛋白表達(dá)的作用；第三部分：亞低溫對(duì)顱腦外傷后大腦組織。 第—部分大鼠液壓沖擊顱腦損傷后常溫和亞低溫治療模型的建立 目的：理想的顱腦損傷動(dòng)物模型是研究顱腦損傷機(jī)制及其診療方法的重要平臺(tái)。建立常溫和亞低溫條件下液壓沖擊腦損傷動(dòng)物模型。評(píng)估致傷模型的有

4、效性及傷后腦組織的改變是否符合實(shí)驗(yàn)要求。為深入開(kāi)展顱腦創(chuàng)傷的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為：假手術(shù)組(n=10)；液壓腦損傷常溫組(n=10)；液壓腦損傷亞低溫組(n=10)。(2)液壓沖擊腦損傷動(dòng)物模型建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2％戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔麻醉，固定頭部于動(dòng)物立體定位儀。頭皮正中切口3cm，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點(diǎn)偏右4mm顱鉆鉆孔，骨窗直徑4.8mm，暴露完整硬腦膜。顱

5、骨固定螺絲兩枚，置入內(nèi)徑2.6mm打擊管，牙科骨水泥牢固固定后縫合消毒頭皮切口。術(shù)后予氣管插管，股動(dòng)脈置管，動(dòng)物用多導(dǎo)生理監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)動(dòng)物血壓、心率變化。動(dòng)物出現(xiàn)夾足反應(yīng)時(shí)，用液壓腦損傷打擊儀壓力180～200 kPa造成中度腦損傷。手術(shù)過(guò)程用溫度計(jì)及腦溫儀監(jiān)測(cè)肛溫和顳肌溫度。假手術(shù)組同樣行顱骨鉆孔和埋管處理，但未遭受打擊損傷。(3)亞低溫治療的實(shí)施：亞低溫組腦損傷后將動(dòng)物置于降溫毯上，30min內(nèi)腦溫及肛溫降至32℃～33℃，應(yīng)用加熱墊

6、及冰袋維持亞低溫4h。常溫組傷后保持體溫(37±0.3℃)4h。(4)指標(biāo)檢測(cè)和采集：各組均進(jìn)行生命體征監(jiān)測(cè)、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、大體標(biāo)本觀測(cè)和病理切片觀察。研究標(biāo)本采用低溫下取大鼠受傷大腦皮層周?chē)M織，液氮保存。 結(jié)果：結(jié)果顯示，各組大鼠成功建立液壓腦損傷及亞低溫模型，常溫組傷后維持體溫(37±0.3℃)4h，亞低溫組維持體溫(32.5±0.5℃)4h。通過(guò)損傷前后表現(xiàn)及病理生理功能的監(jiān)測(cè)，證實(shí)致傷裝置能導(dǎo)致大鼠致傷后出現(xiàn)明顯的改

7、變，尤其損傷早期各指標(biāo)變化明顯，病理形態(tài)學(xué)顯示中度腦損傷改變。亞低溫過(guò)程中大鼠動(dòng)脈血壓、心率、呼吸等指標(biāo)基本保持正常范圍。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該動(dòng)物模型與臨床上接受亞低溫治療的顱腦損傷患者的病理學(xué)改變和病理生理特點(diǎn)極其相似，符合實(shí)驗(yàn)要求。我們成功地建立了大鼠常溫和亞低溫顱腦損傷模型，為下一步亞低溫腦保護(hù)機(jī)制的研究提供了良好條件。 第二部分：顱腦外傷后亞低溫治療對(duì)Calpain基因和蛋白表達(dá)的作用 目的：Calpai

8、n是中樞神經(jīng)半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，Calpain主要集中于它對(duì)細(xì)胞骨架蛋白，即血影蛋白(Spectrin)、微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)和神經(jīng)絲(Neurofilament)的水解破壞從而參與繼發(fā)性腦損傷。亞低溫治療對(duì)Calpain活性的影響尚未完全闡明。本研究立足于探討亞低溫治療對(duì)顱腦外傷后Calpain基因和蛋白表達(dá)的影響。 方法：將27只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=3)，常溫腦損傷組(n=12)和亞低溫腦損傷組(

9、n=12)。腦損傷組分別接受右頂部側(cè)方中度液壓損傷打擊(FPI)，其中亞低溫組在傷后即刻接受持續(xù)4小時(shí)的亞低溫治療(肛溫32±0.5℃)。在傷后6h、12h、24h和72h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別處死3只常溫和亞低溫?fù)p傷組大鼠，通過(guò)熒光PCR、Westernblot半定量檢測(cè)各組打擊傷灶周?chē)べ|(zhì)鈣蛋白酶Calpain基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分子表達(dá)的水平，同時(shí)運(yùn)用免疫熒光觀察Calpain蛋白分布情況。 結(jié)果：與常溫組比較，亞低溫使顱腦外傷后12h

10、及24hCalpain基因的轉(zhuǎn)錄較正常對(duì)照和同時(shí)間點(diǎn)常溫腦損傷組顯著增加(P<0.05)；但是，傷后6h、12h、24h和72h亞低溫治療均使Calpain在蛋白分子水平較同時(shí)間點(diǎn)常溫腦損傷組表達(dá)升高的程度顯著抑制(P<0.05)。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鈣蛋白酶Calpain活性及其蛋白水解作用，在顱腦創(chuàng)傷后級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中起著重要作用。亞低溫療法能明顯抑制其表達(dá)。亞低溫治療的腦保護(hù)機(jī)制可能通過(guò)抑制Calpain蛋白分子的表達(dá)，參與

11、與抑制細(xì)胞內(nèi)Calpain的蛋白水解作用有關(guān)。 第三部分亞低溫對(duì)顱腦外傷后大腦組織MAP-2基因和蛋白表達(dá)的影響 目的：亞低溫的腦保護(hù)機(jī)制尚未完全明了，本研究探討亞低溫治療對(duì)顱腦外傷后大腦組織MAP-2基因和蛋白表達(dá)的影響。 方法：將27只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=3)，常溫腦損傷組(n=12)和亞低溫腦損傷組(n=12)，損傷組分別接受右頂部側(cè)方中度液壓損傷打擊(FPI)，其中亞低溫腦損傷組在傷后即刻接受持

12、續(xù)4小時(shí)的亞低溫治療(肛溫32±0.5℃)，在傷后6h，12h，24h和72h分別處死3只常溫和亞低溫腦損傷組大鼠，通過(guò)熒光PCR、Westernblot半定量檢測(cè)各組大腦半球打擊傷灶周?chē)べ|(zhì)MAP-2基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分子的表達(dá)水平。 結(jié)果：顱腦外傷后各組MAP-2基因轉(zhuǎn)錄均下降，而亞低溫治療使6h，12h和24h MAP-2基因的轉(zhuǎn)錄較同時(shí)間點(diǎn)常溫腦損傷組明顯增加(p<0.05)。常溫腦損傷組6h、12h及72h MAP-2蛋白

13、的表達(dá)都較正常對(duì)照組顯著增加(p<0.05)，6h及12h亞低溫腦損傷組MAP-2蛋白表達(dá)也較正常對(duì)照組顯著增加(p<0.05)，而24h亞低溫腦損傷組則較正常對(duì)照組表達(dá)下降(P<0.05)。 結(jié)論：(1)顱腦外傷后亞低溫治療可直接影響MAP-2的基因轉(zhuǎn)錄或蛋白表達(dá)，亦可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣蛋白酶Calpain表達(dá)而間接作用于MAP-2蛋白分子的表達(dá)。(2)本實(shí)驗(yàn)證明，亞低溫不僅抑制鈣蛋白酶Calpain的活性表達(dá)，而且還能減少其作用底